प्रोस्टेट कैंसर और अन्य उम्र संबंधी विकृतियों या चयापचय रोगों में एक Biophysical उत्प्रेरक के रूप में अध्ययन करने के लिए कैसे तहखाने झिल्ली अकड़न
Summary
यहाँ हम biophysical microenvironment जहां crosslinking और तहखाने झिल्ली (बीएम) उन्नत ग्लिकेशन endproducts (उम्र) द्वारा प्रेरित की वृद्धि की कठोरता रोग प्रासंगिकता है मॉडलिंग के लिए एक प्रोटोकॉल समझाओ।
Abstract
यहाँ हम एक प्रोटोकॉल है कि biophysical उम्र से संबंधित विकृतियों और चयापचय विकारों (जैसे कैंसर, मधुमेह, microvascular रोग, रेटिनोपैथी, नेफ्रोपैथी और न्यूरोपैथी) के दौरान वृद्धि की मोटाई और तहखाने झिल्ली (बीएम) की कठोरता से संबंधित microenvironment अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता का वर्णन । मॉडल के आधार गैर enzymatic glycolaldehyde (GLA) के साथ इलाज के द्वारा पुनर्गठित बीएम (RBM) मैट्रिक्स की crosslinking Maillard प्रतिक्रिया के माध्यम से उन्नत ग्लिकेशन endproduct (उम्र) पीढ़ी को बढ़ावा देना है। प्रयोगशाला तकनीकों के उदाहरण है कि उम्र पीढ़ी, गैर एंजाइमी crosslinking पुष्टि करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और जी एल ए में वृद्धि की कठोरता का इलाज किया RBM रेखांकित कर रहे हैं। भामिति विश्लेषण और immunofluorescent माइक्रोस्कोपी, सोडियम सल्फेट dodecyl polyacrylamide द्वारा अपने गैर एंजाइमी crosslinking द्वारा अपनी उम्र सामग्री: इनमें से निर्धारण के लिए मूल निवासी RBM और कठोर RBM (जीएलए के साथ इलाज) (फॉस्फेट बफर खारा, पीबीएस के साथ इलाज) की तैयारी शामिलजेल वैद्युतकणसंचलन (एसडीएस पृष्ठ) के साथ ही confocal माइक्रोस्कोपी, और इसके rheometry का उपयोग कर वृद्धि की कठोरता। प्रक्रिया यहाँ वर्णित RBM की कठोरता (लोचदार moduli, ई), 3.2 गुना तक बढ़ाने के लिए बनाम रोगग्रस्त मानव प्रोस्टेट ऊतक स्वस्थ में किए गए माप के साथ लगातार इस्तेमाल किया जा सकता है। biophysical उम्र बढ़ने और रोगग्रस्त प्रोस्टेट के साथ जुड़े microenvironment विश्राम करने के लिए ग्रंथि तीन प्रोस्टेट सेल प्रकार मूल निवासी RBM और कठोर RBM करने पर पेश किया गया: RWPE -1, प्रोस्टेट उपकला कोशिकाओं (पेक्स) एक सामान्य प्रोस्टेट ग्रंथि से निकाली गई; BPH-1, एक प्रोस्टेट ग्रंथि सौम्य prostatic hyperplasia (BPH) से प्रभावित से निकाली गई पेक्स; और PC3, मेटास्टेटिक कोशिकाओं को एक माध्यमिक हड्डी के ट्यूमर प्रोस्टेट कैंसर से होने से निकाली गई। एकाधिक मापदंडों आकार, आकृति और 3 डी ग्रंथियों बनाम कड़ी RBM देशी पर RWPE -1 और बीपीएच -1 द्वारा गठित acini की आक्रामक विशेषताओं, और औसत सेल लंबाई, प्रवासी वेग और 3 डी spher की सेल आंदोलन के हठ सहित मापा जा सकता हैएक ही परिस्थितियों में PC3 कोशिकाओं द्वारा गठित OIDs। सेल रास्ते और प्रोटीन की subcellular स्थानीयकरण संकेत भी मूल्यांकन किया जा सकता है।
Introduction
The basement membrane (BM) is a sheet of specialized extracellular matrix (ECM) that maintains stable tissue borders by separating layers of epithelial cells from the stroma1. Covalent crosslinking between adjacent triple helices of collagen IV in the BM stabilizes their lateral association by establishing an irregular network of super-twisted helices2. These collagen IV lattices act as a scaffold for its interaction with laminin and other BM components1. The structural arrangement of the BM provides it with the mechanical strength and rigidity necessary for the normal development of glandular epithelia3.
During aging and disease the BM progressively thickens and stiffens3,4. For example, a 3-fold increase in the elastic modulus (E) of the ocular BM occurs between the ages of 50 and 80 in the normal population, and this stiffening is further exacerbated in metabolic disorders like diabetes5. The structural and biomechanical changes in the BM that result in its increased stiffness occur when its ECM components, collagen IV and laminin, become non-enzymatically crosslinked following their exposure to advanced glycation endproducts (AGEs).
The purpose of the method described here was to establish a model for the investigation of how BM stiffness, due to AGE exposure, promotes prostate epithelial cell (PEC) and prostate tumour cell (PTC) invasiveness in the context of the switch to metastatic prostate cancer (PCa). To do this a previous method used for generating 3D glandular acini from mammary epithelial cells (MECs) in reconstituted rBM gels6 was adapted to include an additional step where the rBM gels are pre-treated with glycolaldehyde (GLA). Several techniques for assessing GLA induced crosslinking and stiffening of pre-treated rBM gels are described, including photometric analysis, sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS PAGE), confocal microscopy and rheometric analysis. The prostate cell types selected for culture on the pre-stiffened rBM include: RWPE-1, PECs derived from a normal prostate gland7; BPH-1, PECs derived from a prostate gland affected by BPH8; and PC3, metastatic PTCs derived from a secondary tumor located in the vertebral bone of a prostate cancer (PCa) patient9.
In addition to advancing the study of prostate gland pathology, the protocol for stiffening of rBM gels by their treatment with GLA can be adapted to investigate how BM stiffness contributes to other age-related pathologies and metabolic disorders. For example, the model can be directly applied to investigate how metastatic cancer is induced by BM stiffness in organs such as the breast, colon, ovary and pancreas by the incorporation of appropriate cell types. Furthermore, the protocol can be adapted to investigate how stiff BM promotes biomechanical mechanisms of disease progression in diabetes-related microvascular disease, retinopathy, nephropathy and neuropathy.
Protocol
Representative Results
Discussion
शुद्ध RBM जैल 6 में से 3 डी MECS ग्रंथियों acini की पीढ़ी के लिए एक प्रोटोकॉल 4 मिलीग्राम / एमएल प्रकार के अलावा मैं RBM मैट्रिक्स के लिए कोलेजन द्वारा पिछले एक अध्ययन में संशोधित किया गया था। कोलेजन के अलावा RBM जेल से 175 ± 37 1589 ± 380 पास्कल को बढ़ाने की लोचदार मापांक में हुई। कठोरता में यह 9.1 गुना वृद्धि विकास, अस्तित्व, प्रवास और MECS 21 के भेदभाव संग्राहक। – (-) – राइबोज़ प्रकार मैं कोलेजन कि RBM जेल में जोड़ा गया था की गैर enzymatic crosslinking बढ़ावा देने के लिए प्रोटोकॉल डी के साथ एक इलाज के कदम शामिल करके फिर से संशोधित किया गया था। कठोरता में परिणामी 15 गुना वृद्धि MECS की ऑन्कोजेनिक परिवर्तन के साथ सहयोग करने की अपनी आक्रामक व्यवहार 22 बढ़ावा देने के लिए मिला था। उनका कहना है प्रकार की प्रयोगात्मक दृष्टिकोण मैं RBM जैल के लिए कोलेजन कोलेजन फाइबर, जो केवल स्ट्रोमा के बीच शारीरिक बाधा के बाद मानव ऊतकों में होता है साथ MECS की सीधी बातचीत की सुविधाऔर बीएम द्वारा प्रदान की उपकला प्रोटिओलिटिक गिरावट आए। शुद्ध RBM जैल जीएलए के साथ पूर्व इलाज में पेक्स से 3 डी ग्रंथियों acini पैदा करके, मौजूदा प्रोटोकॉल का अध्ययन करने के लिए कैसे बी.एम. कठोरता से प्रति उनकी आक्रामक व्यवहार (चित्रा 3) को गति प्रदान कर सकते हैं रास्ता खुल जाता है। बी.एम. कठोरता के स्तर में इस प्रोटोकॉल में प्रेरित शारीरिक प्रासंगिकता है। 6 घंटा और 14 घंटे के लिए 50 मिमी जीएलए के साथ ऊष्मायन क्रमश: 175 ± 90 और 322 ± 160 शुद्ध RBM जेल की लोचदार moduli वृद्धि हुई पीबीएस (तालिका 1) के साथ इलाज RBM जैल में 122 ± 55 पास्कल की तुलना में। RBM कठोरता में यह 1.7 के लिए 3.2 गुना वृद्धि सामान्य प्रोस्टेट या BPH ऊतक 23-26 की तुलना में घातक में मनाया कठोरता में 2.5 3.4 गुना वृद्धि का स्मरण दिलाता है। जैसा कि पीईसी acini में उम्र और RBM कठोरता के संचय से प्रेरित 13 morphological परिवर्तन हाल के एक प्रकाशन में उल्लिखित गिरफ्तारी से एक सांख्यिकीय महत्वपूर्ण बदलाव के लिए मात्रा निर्धारित किया जा सकता हैबहुभुज आकार के ounded, ल्यूमिनल / कुल कोष्ठकी क्षेत्र, और उम्र के अमीर RBM (चित्रा 3) में acina से पलायन फैला हुआ कोशिकाओं की कमी हुई। Immunoblotting भी EMT के मार्कर का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और सिकुड़ा व्यवहार (जैसे फॉस्फोरिलेटेड मायोसिन प्रकाश श्रृंखला -2, pMLC2 13) बनाम कड़ी RBM सामान्य में उगाया पेक्स में (चित्रा 3) (ई cadherin 13 के जैसे हानि)। Immunofluorescent धुंधला और confocal माइक्रोस्कोपी का उपयोग आगे मूल्यांकन बी.एम. कल्पना करने के लिए लागू किया जा सकता है (उदाहरण के laminin, कोलेजन चतुर्थ और उम्र संचय 13), सेलुलर शिखर करने वाली बेसल polarity (EEA1 की जैसे शिखर स्थानीयकरण: जल्दी endosomal प्रतिजन 1; और GM130: 130 केडीए सीआईएस Golgi मार्कर 13) और आसंजन अणुओं के सेलुलर पैटर्न (सेल सेल जंक्शनों से 13 जैसे ई cadherin स्थानीयकरण) (चित्रा 3)।
<img aएलटी = "चित्रा 3" src = "/ files / ftp_upload / 54230 / 54230fig3.jpg" />
चित्रा 3:। विभिन्न यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल का अवलोकन आरेख को दर्शाया गया है तैयार करने और पुनर्गठन तहखाने झिल्ली (RBM) glycolaldehyde (Maillard प्रतिक्रिया) के साथ, कैसे कठोर RBM करने पर कोशिकाओं बीज के लिए, कैसे कठोर RBM विश्लेषण करने के लिए ठोस बनाना करने के लिए कैसे ( Maillard प्रतिक्रिया) और प्रक्रियाओं है कि उम्र के अमीर RBM से प्रेरित सेलुलर और आणविक परिवर्तन का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता की हद तक। उम्र, उन्नत ग्लिकेशन endproducts; बी.एम., तहखाने झिल्ली; DAPI, 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole; EEA1, जल्दी endosomal प्रतिजन 1; GAPDH, glyceraldehyde-3-फॉस्फेट डिहाइड्रोजनेज; जी एल ए, glycolaldehyde; जी, ग्लाइसिन एथिल एस्टर; GM130, 130 केडीए सीआईएस Golgi मार्कर; पी-MLC2 (Thr18 / Ser19), मायोसिन प्रकाश श्रृंखला -2 स्थलों पर phosphorylated 18 और 19 सेरीन threonine; RBM, पुनर्गठन तहखाने झिल्ली; एसडीएस पृष्ठ, सोडियम सल्फेट dodecyl जेल वैद्युतकणसंचलन। RWPE1 acini स्केल पट्टी के लिए = 10 माइक्रोन; PC3 ट्यूमर सेल के लिएspheroids स्केल बार = 100 माइक्रोन। यह आंकड़ा संदर्भ 13 से संशोधित किया गया है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
– (-) – राइबोज़ RBM के लिए crosslinking एजेंट के रूप में चुना है यदि D समस्या निवारण चरण आवश्यक हो जाएगा। प्रोटोकॉल के विकास के दौरान यह पाया गया कि 1 एम डी के साथ उपचार – (-) – 72 घंटे के लिए राइबोज़, पहले RBM / कोलेजन जैल 22 के लिए वर्णित के रूप में, निर्जलीकरण और RBM जैल की सिकुड़न में हुई। – (-) – डी की कम सांद्रता के मूल्यांकन राइबोज़ और कम उपचार बार इस सीमा को पार करने के लिए मदद मिल सकती है।
जहां RBM कठोरता के उच्च स्तर वांछित हैं प्रोटोकॉल के भविष्य के अनुप्रयोगों में एक संभावित सीमा से सामना हो सकता है। अब ऊष्मायन बार और जी एल ए के उच्च सांद्रता RBM जेल कठोरता के उच्च स्तर को प्रेरित करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं तो यह जरूरी होगा आकलन इन उपचार की स्थिति सेल अस्तित्व और प्रसार पर प्रभाव पड़ता है, चाहे के रूप में पहले 13 में वर्णित है। यह भी ध्यान दिया जाना चाहिए कि सीरम के साथ RWPE-1 कोशिकाओं के ऊष्मायन एक प्ररूपी EMT-जैसे संक्रमण और सीरम या सीरम युक्त सामग्री के लिए जोखिम से बचा जाना चाहिए लाती है। उदाहरण के लिए, यदि प्रयोगों कम आरएनए (siRNA) ओलईगोन्युक्लियोटाईड्स हस्तक्षेप के अभिकर्मक शामिल है, प्रक्रिया KSFM में उगाया RWPE -1 कोशिकाओं का उपयोग कम सीरम अभिकर्मक मीडिया के लिए कोशिकाओं स्विचन के बिना अनुकूलित किया जाना चाहिए। इस खामी जीन के स्तर से समझौता कर सकता हासिल मुंह बंद जब क्षणिक siRNA का उपयोग कर मॉडल में दृष्टिकोण। कुछ प्रोटीन लक्ष्य के लिए यह ट्यून करने योग्य जीन मुंह बंद करने और प्रोटीन के स्तर में कमी के लिए वांछित inducible shRNA वैक्टर को रोजगार के लिए सलाह दी है। रूपांतरों कि stromal सेल या ट्यूमर सेल जुड़े lysyl oxidase (LOX) 17 से एंजाइमी crosslinking को शामिल भी भविष्य के मॉडलों में शामिल किया जा सकता है।
jove_content "> इस प्रोटोकॉल समर्थक आक्रामक (RWPE -1, बीपीएच -1) पेक्स में उम्र पर निर्भर बी.एम. कठोरता से शुरू हो रहा तंत्र और आक्रामक पीटीसी (PC3) में विरोधी मेटास्टेटिक लक्ष्यों के मूल्यांकन के भविष्य के अध्ययन की सुविधा होगी। यह देखते हुए कि बीपीएच एक चयापचय विकार 27 माना जाता है, इस प्रोटोकॉल भी चयापचय विकारों और बढ़ प्रोस्टेट कैंसर के खतरे के बीच की कड़ी के बारे में हमारी समझ में सुधार की दिशा में मार्ग प्रशस्त। बी.एम. को देखते हुए कठोरता उम्र के लिए अपने जोखिम से प्रेरित अन्य कैंसर में invasiveness के लिए एक ट्रिगर हो सकता है कि प्रकार, यह प्रोटोकॉल का उपयोग करने के लिए इसी तरह के मॉडल है कि अन्य अंगों (जैसे स्तन, पेट, अंडाशय, अग्न्याशय) से सामान्य उपकला कोशिकाओं और ट्यूमर कोशिकाओं को शामिल स्थापित करने के लिए ब्याज की हो जाएगा।प्रोटोकॉल के भीतर महत्वपूर्ण कदम है, साथ में उनकी समय के साथ, चित्रा 4 में संक्षेप हैं। प्रारंभिक कदम के दौरान यह 4 डिग्री सेल्सियस पर RBM के शेयर समाधान बनाए रखने के लिए यह अपनी नीति को रोकने के लिए thaws जबकि आवश्यक हैymerization। जब तक वे 4 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा कर दिया है पिपेट सुझावों के आरएम शेयर समाधान में नहीं रखा जाना चाहिए। अगले कदम के लिए यह भी सुनिश्चित करने के लिए कक्ष स्लाइड 4 डिग्री सेल्सियस तक equilibrated है इससे पहले कि वे RBM समाधान के साथ लेपित हैं महत्वपूर्ण है। जैसे ही RBM समाधान के तापमान 4 डिग्री सेल्सियस से ऊपर की वृद्धि हुई है यह अपरिवर्तनीय polymerization एक जेल के रूप में करने से गुजरना होगा। यह जरूरी है RBM सुनिश्चित करने के लिए कि यह रूपों एक भी सेल संस्कृति और सूक्ष्म विश्लेषण के लिए उपयुक्त सतह polymerization चरण के दौरान परेशान नहीं है कि। के साथ या Maillard प्रतिक्रिया (सोडियम cyanoborohydride और amingoguanidine) के अवरोधकों के बिना जी एल ए के साथ ऊष्मायन की अवधि निर्धारित होगा कि कैसे कड़ी RBM जेल हो जाता है। यह जीएलए के साथ एक 6 घंटा ऊष्मायन का उपयोग करने के लिए अगर अर्द्ध कठोर शर्तों के लिए आवश्यक हैं की सिफारिश की है, और 14 घंटा ऊष्मायन यदि कड़ी शर्तों के लिए आवश्यक हैं (तालिका 1)। वैकल्पिक ऊष्मायन बार या जीएलए की सांद्रता विभिन्न स्तरों यदि इस्तेमाल किया जा सकताकठोरता के वांछित हैं। RBM जैल के इस मामले रियोलॉजिकल विश्लेषण में एक आवश्यक कदम के रूप में शामिल किए जाने की जरूरत है। और पीबीएस के साथ बाद में धोने कदम जी के साथ ऊष्मायन से Maillard प्रतिक्रिया शमन के कदम के बाद, RBM जैल तुरंत इस्तेमाल किया या सेल संस्कृति के लिए उनके उपयोग करने से पहले अप करने के लिए 48 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है। एक बार सेल संस्कृतियों स्थापित कर रहे हैं यह हर दो दिन (किसी भी उपचार सहित) संस्कृति के माध्यम से बदलने के लिए महत्वपूर्ण है। यह जांच के तहत मापदंडों के अनुसार 3-12 दिनों के लिए 3 डी सेल संस्कृतियों को बनाए रखने की सिफारिश की है। 3 डी के लिए पीईसी acini यह 3 डी पीटीसी spheroids विश्लेषण पहले उदाहरण में संस्कृति के 3 दिनों के बाद सिफारिश की है के लिए 6 दिनों के बाद संस्कृतियों का विश्लेषण करने की सिफारिश की है, और।
चित्रा 4:। महत्वपूर्ण कदम है और समय के साथ प्रोटोकॉल का सरल अवलोकन संकेत Floडब्ल्यू आरेख को दर्शाया गया है तैयार करने और पुनर्गठन तहखाने झिल्ली (RBM) महत्वपूर्ण कदम है और संकेत समय के साथ glycolaldehyde (Maillard प्रतिक्रिया) के साथ ठोस बनाना करने के लिए कैसे। अंक जहां प्रोटोकॉल रोका जा सकता है, और RBM जैल संग्रहीत है, यह भी संकेत कर रहे हैं। RBM, पुनर्गठन तहखाने झिल्ली; जी एल ए, glycolaldehyde; जी, ग्लाइसिन एथिल एस्टर; पर, रात भर; पीबीएस, फॉस्फेट खारा बफर; आर टी, कमरे के तापमान। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Simon Hayward (Vanderbilt University Medical Center) for the BPH-1 cells; and Thomas Cox and Janine Erler (Biotech Research & Innovation Centre, University of Copenhagen) for their assistance with rheological measurements. MR-T was funded by Worldwide Cancer Research, formerly The Association of International Cancer Research (Grant 08-0803 to JS), The British Embassy Montevideo and Agencia Nacional de Investigacion e Innovacion (UK_RH_2015_1_2 to MR-T). MC was supported by Prostate Cancer UK (Grant S14-017 to JS and GS). KW was funded by The China Scholarship Council. MAM was funded by The Saudi Arabian Cultural Bureau.
Materials
| I – Material for monolayer culture | |||
| BPH-1 | CaP Cell Line Database | PCaCL-132 | Contact: simon.hayward@mcmail.vanderbilt.edu |
| Complete keratinocyte serum-free media | ThermoFisher Scientific | 17005-075 | Do not warm at 37 ºC before use |
| Fetal calf serum | First Link UK Ltd | 02-00-850 | Store at -20 ºC in aliquots |
| PC3 | American Type Culture Collection | CRL-1435 | |
| Penicillin/streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15070-063 | |
| Phosphate Buffer Saline (Dulbecco A) tablets | Oxoid | BR0014G | |
| RPMI 1640 medium | Sigma-Aldrich | R5886 | warm in 37 ºC water bath before use |
| RWPE-1 | American Type Culture Collection | CRL-11609 | |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma-Aldrich | T4049 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| II – Material for 3D culture | |||
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 271004 | |
| Aminoguanidine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 396494 | Irritating to eyes, respiratory system and skin |
| Chamber slides, 8-well | Thermo Scientific Nunc Lab-Tek | TKT-210-816M | |
| Culture Matrix reconstituted basement membrane (rBM) reduced growth factor extract | AMS Biotechnology | 3445-005-01 | Store Basement membrane (BM) at -80 ºC in aliquots |
| Cyanogen bromide | Sigma-Aldrich | C91492 | Toxic by contact skin and inhalation |
| Formic acid | Sigma-Aldrich | 695076 | |
| Glycine ethyl ester hydrochloride (GEE) | Sigma-Aldrich | 50060 | Irritating to eyes |
| Glycolaldehyde dimer (GLA) | Sigma-Aldrich | G6805 | |
| Sodium cyanoborohydride | Sigma-Aldrich | 71435 | Highly flammable; Toxic by contact skin and inhalation |
| Syringe filter 0.22 microns | Appleton Woods | BC680 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| III – Material to quantify Maillard reaction | |||
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | ThemoFisher Scientific | D3571 | light sensitive and store at -20 ºC in aliquots |
| Cloning cylinders | Sigma-Aldrich | C1059 | |
| Goat anti-mouse IgG (H+L) Alexa Fluor 488 conjugate | ThemoFisher Scientific | A-11001 | light sensitive |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 488 conjugate | ThemoFisher Scientific | A-11034 | light sensitive |
| Goat serum | Abcam | ab7481 | Store at -20 ºC in aliquots |
| Vectashield mounting media | Vector Laboratories | H-1000 | |
| Mouse anti-pentosidine clone PEN-12 mAb | TransGenic Inc | KH012 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | F8775 | Store at -20 ºC in aliquots |
| Rabbit anti-human collagen IV polyclonal antibody | Acris Antibodies | R1041 | Store at -20 ºC in aliquots |
| Rabbit anti-laminin A/C pAb | Santa Cruz Biotechnology Inc | sc-7292 | Store at -20 ºC in aliquots |
| Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether (Triton-X100) | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| Polyethylene glycol sorbitan monolaurate (Tween-20) | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Dialysis cassette Slide-A-Lyzer | ThemoFisher Scientific | 66333 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| IV – Equipment | |||
| ARG2 controlled strain rotational rheometer | T.A. Instruments | ||
| Axiovert S100 (20x magnification) microscope | Zeiss | ||
| CO2 controlled humidified incubation chamber for Zeiss Axio S100 microscope | Solent Scientific | ||
| Confocal Axiovert 200M (40x, 63x magnification) microscope | Zeiss | ||
| Olympus LH50A microscope fitted with a digital camera using phase-contrast | Olympus | ||
| PHERAstar Plus plate reader spectrophotometer | BMG Labtech | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| V – Software | |||
| Image J 1.47v | National Institute of Health, USA | ||
| MetaXpress | Molecular Divices |
References
- Timpl, R., Brown, J. C. Supramolecular assembly of basement membranes. Bioessays. 18 (2), 123-132 (1996).
- Yurchenco, P. D., Ruben, G. C. Type IV collagen lateral associations in the EHS tumor matrix. Comparison with amniotic and in vitro networks. Am J Pathol. 132 (2), 278-291 (1988).
- Halfter, W., et al. Protein composition and biomechanical properties of in vivo-derived basement membranes. Cell Adh Migr. 7 (1), 64-71 (2013).
- Candiello, J., Cole, G. J., Halfter, W. Age-dependent changes in the structure, composition and biophysical properties of a human basement membrane. Matrix Biol. 29 (5), 402-410 (2010).
- To, M., et al. Diabetes-induced morphological, biomechanical, and compositional changes in ocular basement membranes. Exp Eye Res. 116, 298-307 (2013).
- Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures. Methods. 30 (3), 256-268 (2003).
- Bello, D., Webber, M. M., Kleinman, H. K., Wartinger, D. D., Rhim, J. S. Androgen responsive adult human prostatic epithelial cell lines immortalized by human papillomavirus 18. Carcinogenesis. 18 (6), 1215-1223 (1997).
- Hayward, S. W., et al. Establishment and characterization of an immortalized but non-transformed human prostate epithelial cell line: BPH-1. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 31 (1), 14-24 (1995).
- Kaighn, M. E., Narayan, K. S., Ohnuki, Y., Lechner, J. F., Jones, L. W. Establishment and characterization of a human prostatic carcinoma cell line (PC-3). Invest Urol. 17 (1), 16-23 (1979).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc Natl Acad Sci U S A. 76 (9), 4350-4354 (1979).
- Rabilloud, T. Mechanisms of protein silver staining in polyacrylamide gels: a 10-year synthesis. Electrophoresis. 11 (10), 785-794 (1990).
- Rodriguez-Teja, M., et al. AGE-modified basement membrane cooperates with Endo180 to promote epithelial cell invasiveness and decrease prostate cancer survival. J Pathol. 235 (4), 581-592 (2015).
- Graf, B. W., Boppart, S. A. Imaging and analysis of three-dimensional cell culture models. Methods Mol Biol. 591, 211-227 (2010).
- Yao, N. Y., Larsen, R. J., Weitz, D. A. Probing nonlinear rheology with inertio-elastic oscillations. J Rheology. 52 (4), 1013-1025 (2008).
- Baker, A. M., Bird, D., Lang, G., Cox, T. R., Erler, J. T. Lysyl oxidase enzymatic function increases stiffness to drive colorectal cancer progression through FAK. Oncogene. 32 (14), 1863-1868 (2013).
- Caley, M. P., et al. Tumor-associated Endo180 requires stromal-derived LOX to promote metastatic prostate cancer cell migration on human ECM surfaces. Clin Exp Metastasis. 3 (2), 151-165 (2016).
- Sturge, J., Wienke, D., East, L., Jones, G. E., Isacke, C. M. GPI-anchored uPAR requires Endo180 for rapid directional sensing during chemotaxis. J Cell Biol. 162 (5), 789-794 (2003).
- Sturge, J., Wienke, D., Isacke, C. M. Endosomes generate localized Rho-ROCK-MLC2-based contractile signals via Endo180 to promote adhesion disassembly. J Cell Biol. 175 (2), 337-347 (2006).
- Rodriguez-Teja, M., et al. Survival Outcome and EMT Suppression Mediated by a Lectin Domain Interaction of Endo180 and CD147. Mol Cancer Res. 13 (3), 538-547 (2015).
- Paszek, M. J., et al. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer Cell. 8 (3), 241-254 (2005).
- Levental, K. R., et al. Matrix crosslinking forces tumor progression by enhancing integrin signaling. Cell. 139 (5), 891-906 (2009).
- Carson, W. C., et al. Material characterization of ex vivo prostate tissue via spherical indentation in the clinic. Med Eng Phys. 33 (3), 302-309 (2011).
- Hoyt, K., et al. Tissue elasticity properties as biomarkers for prostate cancer. Cancer Biomark. 4 (4-5), 213-225 (2008).
- Krouskop, T. A., Wheeler, T. M., Kallel, F., Garra, B. S., Hall, T. Elastic moduli of breast and prostate tissues under compression. Ultrason Imaging. 20 (4), 260-274 (1998).
- Zhang, M., et al. Quantitative characterization of viscoelastic properties of human prostate correlated with histology. Ultrasound Med Biol. 34 (7), 1033-1042 (2008).
- Corona, G., et al. Benign prostatic hyperplasia: a new metabolic disease of the aging male and its correlation with sexual dysfunctions. Int J Endocrinol. , (2014).
