공장 Polysome 프로파일 링을위한 쉬운 방법
Summary
This protocol describes an easy method to extract and fractionate transcripts from plant tissues on the basis of the number of bound ribosomes. It allows a global estimate of translation activity and the determination of the translational status of specific mRNAs.
Abstract
Translation of mRNA to protein is a fundamental and highly regulated biological process. Polysome profiling is considered as a gold standard for the analysis of translational regulation. The method described here is an easy and economical way for fractionating polysomes from various plant tissues. A sucrose gradient is made without the need for a gradient maker by sequentially freezing each layer. Cytosolic extracts are then prepared in a buffer containing cycloheximide and chloramphenicol to immobilize the cytosolic and chloroplastic ribosomes to mRNA and are loaded onto the sucrose gradient. After centrifugation, six fractions are directly collected from the bottom to the top of the gradient, without piercing the ultracentrifugation tube. During collection, the absorbance at 260 nm is read continuously to generate a polysome profile that gives a snapshot of global translational activity. Fractions are then pooled to prepare three different mRNA populations: the polysomes, mRNAs bound to several ribosomes; the monosomes, mRNAs bound to one ribosome; and mRNAs that are not bound to ribosomes. mRNAs are then extracted. This protocol has been validated for different plants and tissues including Arabidopsis thaliana seedlings and adult plants, Nicotiana benthamiana, Solanum lycopersicum, and Oryza sativa leaves.
Introduction
단백질 합성은 모든 세포 하나에 필수적이고 정력적으로 비용이 많이 드는 과정이다. 우선, 세포 변환 기계, 리보솜의 생산 에너지 투자해야한다. 예를 들어 적극적으로 분할 효모 세포는 분당 많은 2,000 리보솜을 생산하고 있습니다. 이러한 생산량은 전체 전사 활성의 60 %로하고, 전지 (2)의 전체 접합 활성의 90 %까지 필요하다. 또한, 에너지는 아미노산, 아미노 아실 tRNA의 결합 펩티드의 합성에 필요하다. 식물, ATP 3 4.5 5.9 분자 펩티드 사슬 비용으로 하나의 아미노산을 첨가. 따라서,이 단백질의 mRNA의 번역은 변화하는 환경 조건을 처리에 관해서 특히, 규정의 주요 사이트 것은 놀라운 일이 아니다.
리보솜을 가진 mRNA의 협회 인 번역의 개시 단계는,의 조절의 주요 표적이다번역 4. 번역의 조정의 결과뿐만 아니라 다른 후 – 전사 조절 단계로서, 단백질 농도의 변화의 40 %의 mRNA의 풍부 5,6- 의해 설명 될 수있다. 따라서, 전체의 mRNA의 연구는 단백질 풍부에 대한 상대적으로 빈약 한 정보를 제공합니다. 반면에, 리보솜과의 mRNA의 협회는 번역에 관련된 사람들의 mRNA에 대한 액세스를 제공함으로써 단백질 풍부에 대한 정보를 얻을 수 있습니다. 적극적 번역의 mRNA는 polysomes라는 구조에서 여러 가지 변이와 연관됩니다. 반대로, 제대로 번역의 mRNA는 하나의 리보솜 (monosome)와 연결됩니다. 결과적으로, mRNA의 번역의 리보솜 상태 (7)의 연결을 모니터링함으로써 평가 될 수있다.
이 프로토콜 여섯 일 이전 애기 장대 모종, RNA의 연속적인 분리에서 polysomes의 분리 및 결과의 분석을 설명한다. 포lysomes 및 monosomes은 자당 밀도 구배를 통해 분리된다. 그라디언트 여섯 분획으로 수집됩니다. polysomes, monosomes 및 변이와 연관되지 않은 자유 60S와 40S 리보솜 서브 유닛과의 mRNA를 포함하는 가벼운 부분 (이하라고 뜨는) : 분획물 중 일부는 세 가지 잘 분리 분획을 얻기 위해 풀링된다. 글로벌 번역 활성 및 polysomes 프로파일을 비교하여 곡선 아래의 면적의 적분에 의해 결정된다 polysome / monosome 비율을 생성함으로써 추정 될 수있다. 의 mRNA와 단백질은 다른 분수에서 추출 및 RT-PCR, QRT-PCR, 노던 블롯, 마이크로 어레이, 웨스턴 블롯 또는 단백질 체학에 의한 분석에 사용됩니다. 이 프로토콜은 다른 식물과 조직에 대한 검증되었습니다.
이 프로토콜을 수행하는 데 필요한 장비는 일반적으로 대부분의 실험실에서 발견된다 : 구배 머신은 필요 없다. 다음 하나가되지 않도록 추가하기 전에 각 층을 동결층들 중 하나 또는 혼합 교란들. 어떠한 튜브 뚫음은 구배로 유리 모세관의 침지에 의해 달성 될 수 구배 컬렉션에 사용되지 않는다. 따라서, 고가의 초 원심 분리 튜브 손상을 유지하고 여러 번 재사용 될 수있다. 종합적으로,이 의정서 polysome 프로파일에 대한 쉽고 저렴한 방법합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
The protocol we present here is an easy and cheap method for generating polysome profiles and isolating mRNAs associated with polysomes, single ribosomes or free of ribosomes. A wide range of different polysome fractionation methods is described in the literature. The method we have described here has been optimized to keep only the necessary compounds and has been adapted for plant material. In particular, we reduced the amount of detergent11 and added chloramphenicol to the buffer to fix the chloroplastic ri…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 프랑스 국립 연구 기관 (ANR-14 CE02-0010)에 의해 지원되었다. 우리는 원고의 중요한 읽기 박사 벤자민 필드 박사 엘로 디 Lanet 감사합니다. 우리는 비디오 편집과 그의 도움 씨 미셸 테 레스 감사합니다.
Materials
| Ultracentrifuge tube, thinwall, polyallomer – 13.2 ml | Beckman Coulter | 331372 | |
| Ultracentrifuge tube, thinwall, polyallomer – 38.5 ml | Beckman Coulter | 326823 | |
| Glass capillary tube | Drummond Scientific | 1-000-1000 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima series | |
| Ultracentrifuge Rotor SW41 | Beckman Coulter | 331362 | |
| Ultracentrifuge Rotor SW32 | Beckman Coulter | 369650 | |
| Peristaltic pump | Any | ||
| Tygon R3607 polyvinyl chloride tubing | Fisher Scientific | 070534-22 | Polyvinyl chloride tubing, 2.29 mm |
| Fraction collector Model 2110 | Bio-Rad | 731-8120 | |
| UV cuvette | Hellma | 170.700-QS | Quartz flow-through cuvette |
| UV Spectrophotometer | Varian | Cary50 | Read every 0.0125 sec |
| All chemicals | Any | Use only Molecular Biology Grade | |
| Murashige and Skoog Basal Salt Mixture (MS) | Sigma-Aldrich | M5524 | |
| Rnase-Free water | Any | ||
| Petri Dishes | Fisher Scientific | 10083251 | |
| Octylphenoxy poly(ethyleneoxy)ethanol, branched (Nonidet P40) | Euromedex | UN3500 | |
| Linear acrylamide (acryl carrier) | ThermoFischer scientific | AM9520 | RNA precipitation carrier |
| OriginPro 8 | OriginLab | Analysis software |
References
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