This paper presents a sensitive method called Circle-Seq for purifying extrachromosomal circular DNA (eccDNA). The method encompasses column purification, removal of remaining linear chromosomal DNA, rolling-circle amplification and high-throughput sequencing. Circle-Seq is applicable to genome-scale screening of eukaryotic eccDNA and studying genome instability and copy-number variation.
Ekstrakromosomale cirkulære DNA (eccDNAs) er almindelige genetiske elementer i Saccharomyces cerevisiae og er rapporteret i andre eukaryoter også. EccDNAs bidrager til den genetiske variation blandt somatiske celler i flercellede organismer og til udviklingen af encellede eukaryoter. Der er behov for følsomme metoder til påvisning eccDNA at afklare, hvordan disse elementer påvirker genom stabilitet og hvordan miljømæssige og biologiske faktorer inducerer deres dannelse i eukaryote celler. Denne video præsenterer en følsom eccDNA-rensningsmetode kaldet Circle-Seq. Metoden omfatter kolonne rensning af cirkulært DNA, fjernelse af resterende lineære kromosomale DNA, rullende cirkel forstærkning af eccDNA, dyb sekventering, og kortlægning. Omfattende exonukleasebehandling var nødvendig for tilstrækkelig lineær kromosomale DNA-nedbrydning. Det rullende-cirkel amplifikation trinine-height:. normal; "> φ 29 polymerase beriget for cirkulært DNA i lineær DNA Validering af Circle-Seq metode på tre S. cerevisiae CEN.PK populationer af 10 10 celler opdaget hundredvis af eccDNA profiler i størrelser større end 1 kilobase . Gentagne fund af ASP3-1, COS111, CUP1, RSC30, HXT6, HXT7 gener på cirkulært DNA i både S288C og CEN.PK tyder på, at DNA cirkularisering er bevaret mellem stammer på disse loci. i sum, Circle-Seq metode har bred anvendelighed til genom-skala screening for eccDNA i eukaryoter såvel som til påvisning af specifikke eccDNA typer.
Detektering tidligt eller forbigående kromosomale amplifikation er vanskeligt, fordi det kræver at identificere ændringer i enkelte DNA-molekyler i store populationer af celler. Kromosomale kopi-nummer variationer (CNVs) er generelt opdages godt efter deres etablering, så kun den endelige CNV struktur som bevis for den mekanisme, der genererede variation 1,2. Afsløring og inddrive ekstrakromosomalt cirkulært DNA (eccDNA) i tidligere stadier af CNV dannelse kunne belyse igangværende processer i genomiske omlejringer.
Tidligere de novo opdagelse af eccDNA var elektronmikrofotografier 3, Giemsa-farvning af metafasekromosomer 4 eller todimensional gelelektroforese 5. Disse metoder giver lidt eller ingen information om sekvensen af det cirkulære DNA. Målrettede teknikker såsom Southern blotting 6,7, omvendt PCR 8 eller fluorescens in situ hybridization 9 fremlægge dokumentation kun om bestemte eccDNA elementer. Ingen af disse metoder giver sekvensen af alle eksisterende eccDNA typer i en cellepopulation.
Genomisk divergens i en pulje af celler kan karakteriseres ved genom sekventering og / eller flisebelægning arrays 10,11. Detektering af en sletning eller amplifikation ved traditionelle DNA oprensningsmetoder kræver sædvanligvis, at en muteret allel repræsenterer mindst 0,1-1% af cellepopulationen 12,13. Acentriske eccDNAs forventes at være endnu mere transient i en cellekultur grund af deres manglende centromerer og potentiel mangel af DNA syntese ved replikation. Således da de fleste eccDNAs formodentlig er i små mængder og deres sekvenser ligner genomet, er der behov for alternative DNA ekstraktionsmetoder til påvisning eccDNAs.
Adskillige cirkulære DNA oprensningsteknikker udnytte de strukturelle forskelle mellem kromosomer og cirkulært DNA. For eksempel højhastighedsforbindelse ultracentrifugation i cæsium chlorid gradienter anvendes til at isolere 350-3000 basepar (bp) store eccDNAs fra den humane HeLa cancercellelinie 14. Dog kan høj hastighed knække eller nick rygraden i supercoilede cirkulære DNA-strukturer, ændre sedimentationshastigheden 15 og eccDNA udbytte. Dutta og medarbejdere udviklet en fremgangsmåde til de novo, genom-skala identifikation af cirkulært DNA fra musevæv samt fra kulturer af kylling og humane celler 16,17. Deres metode er ekstraktion af kerner fra homogeniseret væv ved saccharose ultracentrifugering efterfulgt af plasmid oprensning og flere runder af enzymatiske reaktioner og DNA ekstraktioner. Deres protokol identificerer primært 200-400 bp eccDNAs, kaldet microDNAs. Dutta og kolleger forsøgte også rensning af microDNAs fra Saccharomyces cerevisiae, men var ude af stand til at optage microDNA fra denne gær arter 16.
Vi har udviklet en ny fremgangsmåde tilde novo detektion af eccDNA fra gær kaldet Circle-Seq. Denne metode giver genom omfattende undersøgelser for cirkulære DNA-molekyler store nok til at bære hele gener og så stort som 86 kilobase (kb) mitokondrie-DNA (mtDNA). The Circle-Seq metode blev udviklet fra en veletableret prokaryot plasmid oprensningsmetode 18,19, optimeret til eukaryote gærceller og kombineret med dyb sekventering. Brug af Circle-Seq tilgang, 1756 forskellige eccDNAs, alle større end 1 kb, blev påvist fra ti S. cerevisiae S288C befolkninger 20. En størrelse cut-off blev valgt at fokusere på eccDNA der var store nok til at bære hele gener. Cirkel-Seq var meget følsomme; det detekterede et enkelt eccDNA inden tusindvis af celler 20. I den aktuelle undersøgelse blev Circle-Seq bruges til at isolere og identificere 294 eccDNAs fra tre biologiske gentagelser af en anden S. cerevisiae gærstamme, CEN.PK. Dataene viser, at eccDNA er en fælles genetisk element i S. cerevisiae-stammer.
The Circle-Seq metode tillader genom-skala detektion af eccDNA fra gærceller med sekvens-niveau opløsning. Fremgangsmåden er en mild eccDNA rensning, der ikke kræver intensiv vortex eller pipettering og bruger kolonne separation ved tyngdekraften at begrænse eccDNA brud som ville føre til exonukleasefordøjelse i det efterfølgende trin. Disse træk ved fremgangsmåden kan være afgørende for at detektere store eccDNAs som indeholder gensekvenser. Circle-Seq opdaget adskillige eccDNAs herunder fuld gener (Datasæt 1). Det detekterede også 86-kb gær mitokondrie-DNA. Således er denne protokol letter oprensning af store cirkulære DNA-elementer. At holde antallet af DNA-ekstraktionstrin til et minimum reducerer risikoen for eccDNA tab og maksimerer udbyttet. Baseret på resultater for kontrol, spiked-in plasmider, Cirkel-Seq er meget følsomme, påvisning af et enkelt cirkulært DNA fra 2.500 celler. Endvidere fjerner rigelige endogene plasmider, såsom 2μ; plasmid eller mitokondrie-DNA kan markant øge følsomheden. Hærdning af 2μ fra gærkulturer er blevet beskrevet 30. Alternativt kan 2μ og mitokondrie-DNA fjernelse opnås med en sjælden-skæring endonuklease, såsom Swal. Imidlertid kunne restriktionsenzymet trin målrette andre eccDNAs af interesse og begrænse det samlede eccDNA udbytte.
Kritiske trin for eccDNA detektion var fjernelse af lineært DNA (trin 3) og DNA-sekventering (trin 5) til en korrekt dybde. For at optage størstedelen af eccDNAs fra en celle population, kan dyb sekventering være påkrævet 20. Parret ende sekventering bør give endnu større tillid eccDNA afsløring, som cirkulære DNA vejkryds forventes at give parret ende læser dette kort discordantly. Disse uoverensstemmelser understøtter opdagelsen af cirkulære DNA-strukturer og kan potentielt anvendes som en yderligere eccDNA-detektion filter.
Den Circle-Seq metoden blev valideret ved brug tre uafhængige S. cerevisiae CEN.PK befolkninger. Fundne sekvenser omfattede tidligere rapporteret eccDNAs, endogene plasmider og spidse-i plasmider og hundredvis af formodede eccDNAs (Datasæt 1). Disse resultater understøtter tidligere Circle-Seq datasæt fra S. cerevisiae S288C 20. Opdagelsen af flere eccDNAs fælles for CEN.PK og S288C populationer indikerer, at disse loci har en tilbøjelighed til at eksistere som cirkulære elementer (figur 4). Vi har tidligere vist, at [GAP1 cirkel] er beriget under kvælstof begrænsede betingelser i CEN.PK baggrunden 8, selvom bevis for [GAP1 cirkel] i andre stammebaggrunde ikke er fundet. Finding af eccDNA fra CUP1-1 RSC30, ASP3-1, COS111, og HXT6 HXT7 loci i både S288C og CEN.PK tyder på, at en disposition for DNA cirkularisering er conserveret mellem gærstammer. Det er fortsat til at blive vist, hvis [HXT6 / 7 cirkel], [ASP3-1 cirkel], [COS111 cirkel], og [CUP1-1 RSC30 cirkel] giver selektive fordele til celler, eller hvis deres eksistens blot er en effekt af høje DNA cirkularisering.
Tilsammen indikerer resultaterne, at Circle-Seq er velegnet til påvisning kilobase mellemstore eccDNAs og har fordele til at identificere eccDNAs med komplette gener. Circle-Seq er en yderst følsom metode, der muliggør hele genom-skala skærme eccDNAs fra gær. The Circle-Seq metode kan åbne et nyt felt for forskning med henblik på at belyse den rolle, eccDNA i at generere gen sletninger og amplificeringer. I betragtning af at DNA-arkitektur og struktur i høj grad er bevaret fra eukaryote gær til højere eukaryoter, Circle-Seq metode bør i princippet være applicable til alle eukaryote celler, med mindre ændringer. På nuværende tidspunkt kræver fremgangsmåden ikke synes at have nogen begrænsninger, selv om dens evne til at oprense megabasestørrelse eccDNAs har endnu ikke vist. Desuden er anvendelsen af ø29 DNA-polymerase, som anvender en rullende cirkel amplifikation metode 31, skaber en bias mod mindre eccDNAs gør eccDNA kvantificering vanskeligere. Circle-Seq registrerer eccDNAs store nok til at bære fuld gener, hvilket gør den velegnet til undersøgelser af dobbelt minutter-cirkulære DNA fra humane somatiske celler. Dobbelt minutter kan bidrage til kræft, når proto-onkogener forstærkes på disse elementer 32-37. Studier af eccDNAs i germlinie celler kunne anvendes til måling af kimlinie mutationsrater og vurdere sædkvaliteten, for eksempel i husdyr. , Cirkel-Seq har således potentialet til opnåelse indsigt i den hastighed, hvormed den genetiske variation opstår i form af kopiantal variation, og føre til en hidtil ukendt forståelse af sygdomme, der involverer genet kopi-nummer variation 38-40.
The authors have nothing to disclose.
Thanks to Kenn D. Møller and Claus Sternberg (DTU) for technical assistance and to Tue S. Jørgensen for quantitative PCR analysis.
Bacto peptone | BD Difco | 211677 | Alternative product can be used. |
Brilliant III SYBR Green PCR Master Mix | Agilent Technologies | 600882 | For qPCR analysis. Alternative product can be used. |
Dextrose (D-glucose) | Carl Roth | HN06.4 | Alternative product can be used. |
Disruptor Beads, 0.5 mm | Scientific Industries, Inc. | SI-BG05 | Glass beads to disrupt plasma cell membranes. Alternative product can be used. |
Ethidium bromide | Carl Roth | 2218.2 | Agarose gel stain for detecting DNA/RNA. |
GeneJet plasmid miniprep kit | Thermo Fisher | K0502 | Plasmid purifcation from bacteria. Alternative product can be used |
NotI, FastDigest | Life Technologies - Thermo Fisher Scientific, USA | FD0594 | Endonuclease. Alternative product can be used. |
Plasmid Mini AX kit | A&A Biotechnology, Poland | 010-50 | Plasmid purifcation kit used to purify eccDNA. |
Plasmid-Safe ATP-dependent DNase kit | Epicentre, USA | E3105K | ATP-dependent exonuclease kit. Alternative product can be used. |
Propidium iodide | Sigma-Aldrich, USA | 81845 | Alternative product can be used. |
pUG6 plasmid | EUROSCARF, Germany | P30114 | Marker gene: loxP-PAgTEF1-kanMX-TAgTEF1-loxP. Plasmid requests: Please contact Dr. Peter Philippsen@unibas.ch |
QIAGEN genomic-tip 100/G | Qiagen, USA | 13343 | Genomic DNA purifcation from yeast. Alternative product can be used. |
REPLI-g Mini Kit protocol | Qiagen, USA | 150023 | Amplification of eccDNA by the phi29 polymerase |
Yeast extract | BD Difco | 210929 | Alternative product can be used. |
Zymolyase 100T (Lyticase, Yeast Lytic Enzyme) | Nordic BioSite, Sweden | Z1004-3 | Alternative product can be used. |
Data access to sequence files | European Nucleotide Archive | EccDNA dataset from Saccharomyces cerevisiae CEN.PK113-7D. Study accession number PRJEB9684. 2nd accession number is ERP010820. Locus tag prefix is BN2032. | |
Strains | |||
Saccharomyces cerevisiae CEN.PK113-7D | Genotype MATa MAL2-8c SUC2 | ||
Saccharomyces cerevisiae yeast deletion library pool | EUROSCARF, Germany | S288c BY4741 pool of 4400 viable single-gene deletion mutants disrubted by KanMX module. Genotypes MATa his3∆1 leu2∆0 met15∆0 ura3∆0 genexxx::KanMX. | |
Equipments | |||
DNA Spectrophotometer | NanoDrop 1000 Spectrophotometer, Thermo Fisher | Measuring DNA concentration. Alternative product can be used. | |
Fluorescence microscopy | Nikon Optronics Magnafire. Red excitation fluorescence filter, 663-738 nm. | Alternative product can be used. | |
Robotic library-build system | Apollo 324, IntegenX Inc. | DNA library preparation. Alternative product can be used. | |
Sequencing platform | Illumina HiSeq 2000 platform, Illumina Inc. | DNA sequencing. Alternative product can be used. | |
Ultrasonicator | Covaris LE220, microTUBE AFA Fiber tubes | Alternative product can be used. | |
Methods | |||
2% YPD media | Mix 10 g Dextrose, 10 g Yeast extract, 20 g Bacto peptone and add H2O to a total volume of 1000 ml and autoclave. | ||
Circle-Seq test on genomic DNA | Genomic DNA was purified (Qiagen) from a pool of the yeast deletion library (Euroscarf). The DNA concentration was measured by nanodrop and 30 µg genomic DNA was pipetted into two micro centrifuge tubes. One micro centrifuge tube was supplemented with 100 nanogram plasmid (pUG6). The DNA samples were purified by Circle-Seq, omitting the protocol steps 1.1-1.3 and 1.5-1.7. The eluted DNA concentrations were measured by nanodrop and the entire DNA yield from sample GD and GD+P was treated with exonuclease for a period of 29 hours. A 10% fraction was collected for phi29-amplification and PCR analysis, while the remaining DNA was subjected to 72 hour exonuclease treatment. The samples were analyzed for linear DNA content by PCR, using the ACT1 gene as chromosomal marker. A 5% fraction of each of the exonuclease treated samples was amplified by the phi29 DNA polymerase for 16 hours (Qiagen). The presence of DNA in each sample was examined by loading an equal amount (7 µl) in wells on an 0.5 µg/ml ethidium-bromide 0.9% agarose gel after running gel-electrophoresis. | ||
Mapping software | Bowtie2 aligner, John Hopkins University | Ultrafast short read alignment. Reference: Langmead B, Salzberg S. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nature Methods. 2012, 9:357-359. | |
Propidium iodide stain | Images of propidium iodine stained DNA were captured by fluorescence microscopy at 100x magnification (100x/1.30 oil, Nikon) in the RFP channel (red excitation fluorescence filter, 663-738 nm) using identical exposition time (5 seconds). | ||
Workflow bioinformatic system | Galaxy, Open source. | A free web-based platform for data intensive biomedical research. References: Goecks, J, Nekrutenko, A, Taylor, J and The Galaxy Team. Galaxy: a comprehensive approach for supporting accessible, reproducible, and transparent computational research in the life sciences. Genome Biol. 2010 Aug 25;11(8):R86. Blankenberg D, Von Kuster G, Coraor N, Ananda G, Lazarus R, Mangan M, Nekrutenko A, Taylor J. "Galaxy: a web-based genome analysis tool for experimentalists". Current Protocols in Molecular Biology. 2010 Jan; Chapter 19:Unit 19.10.1-21. Giardine B, Riemer C, Hardison RC, Burhans R, Elnitski L, Shah P, Zhang Y, Blankenberg D, Albert I, Taylor J, Miller W, Kent WJ, Nekrutenko A. "Galaxy: a platform for interactive large-scale genome analysis." Genome Research. 2005 Oct; 15(10):1451-5. |