Preparación de colonias individuales-cohortes y tratamiento con hormona del trabajador abejas para analizar la fisiología asociada con clases, y / o Sistema Endocrino
Summary
Aquí describimos nuestro protocolo detallado para la preparación de las colonias de abejas de un solo cohortes – una herramienta útil para analizar la fisiología trabajador función asociada. También describimos los protocolos detallados para el tratamiento de los trabajadores con la hormona juvenil y ecdisona para evaluar la participación de estas hormonas en la regulación del comportamiento de los trabajadores y / o fisiología.
Abstract
Honeybee workers are engaged in various tasks related to maintaining colony activity. The tasks of the workers change according to their age (age-related division of labor). Young workers are engaged in nursing the brood (nurse bees), while older workers are engaged in foraging for nectar and pollen (foragers). The physiology of the workers changes in association with this role shift. For example, the main function of the hypopharyngeal glands (HPGs) changes from the secretion of major royal jelly proteins (MRJPs) to the secretion of carbohydrate-metabolizing enzymes. Because worker tasks change as the workers age in typical colonies, it is difficult to discriminate the physiological changes that occur with aging from those that occur with the role shift. To study the physiological changes in worker tissues, including the HPGs, in association with the role shift, it would be useful to manipulate the honeybee colony population by preparing single-cohort colonies in which workers of almost the same age perform different tasks. Here we describe a detailed protocol for preparing single-cohort colonies for this analysis. Six to eight days after single-cohort colony preparation, precocious foragers that perform foraging tasks earlier than usual appear in the colony. Representative results indicated role-associated changes in HPG gene expression, suggesting role-associated HPG function. In addition to manipulating the colony population, analysis of the endocrine system is important for investigating role-associated physiology. Here, we also describe a detailed protocol for treating workers with 20-hydroxyecdysone (20E), an active form of ecdysone, and methoprene, a juvenile hormone analogue. The survival rate of treated bees was sufficient to examine gene expression in the HPGs. Gene expression changes were observed in response to 20E- and/or methoprene-treatment, suggesting that hormone treatments induce physiological changes of the HPGs. The protocol for hormone treatment described here is appropriate for examining hormonal effects on worker physiology.
Introduction
La abeja europea, Apis mellifera, es un insecto eusocial con una sociedad altamente organizada 1. Abejas obreras (casta de trabajo) se dedican a diversas tareas para mantener la actividad de la colonia, y estas tareas cambian de acuerdo a la edad de la abeja obrera después de la eclosión, que se conoce como la división relacionada con la edad del trabajo 2-4. Los trabajadores jóvenes (<13 días de edad) cuidar de la cría de la colmena mediante la secreción de jalea real (abejas nodrizas), mientras que los trabajadores de más edad (> 15 días de edad) recogen el néctar y el polen exterior de la colmena (recolectores) 2-4. La fisiología de los trabajadores cambia en asociación con este cambio de función. Por ejemplo, la función de las glándulas hipofaringe (HPGs), emparejado glándulas exocrinas ubicadas en la cabeza, cambios en asociación con el cambio de rol de enfermería para forrajeo 2,5. HPGs enfermera abeja sintetizan principalmente proteínas principales de la jalea real, que son los principales componentes de la leche de abeja. Por otro lado, para cosechadoras de forraje, principalmente HPGssintetizar enzimas metabolizadoras de hidratos de carbono, tales como α-glucosidasa III, para procesar néctar en miel mediante la conversión de la sacarosa en glucosa y fructosa. Nuestros estudios previos revelaron que la expresión de mrjp2, que codifica una proteína principal de la jalea real y Hbg3, que codifica α-glucosidasa III, los cambios durante el turno de papel 6-9.
Para determinar si los cambios fisiológicos en los tejidos de los trabajadores, incluyendo los HPGs, se asocia con el cambio de papel o con la edad de los trabajadores, que sería útil para manipular la composición de la población de una colonia de abejas, como para preparar un solo cohorte colonias en las que los trabajadores de casi la misma edad realizan tareas diferentes 10,11. Robinson et al. (1989) describe un método para establecer una colonia de una sola cohorte 10. colonias de una sola cohorte comprenden inicialmente una reina y trabajadores de 0-2 días de edad. Varios días después de establecer las colonias, los trabajadores de almost la misma edad asumir diferentes tareas. Algunos trabajadores realizan tareas de enfermería como en las colonias típicas, mientras que otros trabajadores realizan tareas de búsqueda de alimento antes de lo habitual y por lo tanto son llamados recolectores precoces. Comparaciones de expresión génica entre las abejas nodrizas y recolectores precoces proporcionarían información útil acerca de la fisiología de rol asociado de tejidos trabajador 12-16. A continuación, describimos un protocolo detallado para la preparación de las colonias de una sola cohorte para el análisis de la fisiología de roles y / o asociado a la edad de 16 HPGs. También describimos brevemente cómo examinar la expresión de genes de mrjp2 y Hbg3 por reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa cuantitativa (RT-PCR) para evaluar la fisiología HPG.
Además del análisis de la fisiología de los trabajadores en colonias de una sola cohorte, el examen del sistema endocrino es importante para el análisis de los mecanismos de regulación de la fisiología trabajador función asociada. hormona juvenil (JH), que se KNOwn como la hormona del "status quo" en larvas de insectos, acelera el cambio en el papel de la enfermería a la búsqueda de alimento en las abejas obreras 11. Además, ecdisona, que se conoce como la hormona de la muda durante la metamorfosis, podría estar implicada en el cambio de papel como genes que codifican las moléculas de señalización de ecdisona se expresan en los órganos de hongos, un centro superior del cerebro trabajador 17-19. Por lo tanto, también se describe el protocolo detallado utilizado en nuestro estudio anterior 16 para tratar a los trabajadores con 20E, que es una forma activa de la ecdisona, y metopreno, un análogo de JH, para el análisis del efecto del sistema endocrino en HPG fisiología (expresión de mrjp2 y Hbg3).
Protocol
Representative Results
Discussion
Preparación de colonias de una sola cohorte
Aquí describimos el protocolo utilizado en nuestro estudio anterior 16 para preparar colonias de una sola cohorte para el análisis de HPG fisiología asociada con el cambio en el papel de las abejas obreras. Se observaron las abejas nodrizas y recolectores precoces que cumplieran los criterios descritos en los procedimientos de 1.6-1.7 y Figura 2 en las colonias de una sola cohorte (Tabla 1). Las foto…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by a Grant-in-Aid for Scientific Research (B) and a Grant-in Aid for Scientific Research on Innovative Areas ‘Systems Molecular Ethology’ from the Ministry of Education, Culture, Sports, Science and Technology (MEXT) of Japan. T.U. was the recipient of a Grant-Aid from the Japan Society for the Promotion of Science for Young Scientists.
Materials
| UNIPOSCA | Mitsubishi pencil | PC-5M | Marker pen for the application of marks to bees |
| 20-hydroxyecdysone | Sigma Aldrich | H5142 | |
| Methoprene | Sigma Aldrich | 33375 | |
| Breeding case insect | IRIS OHYAMA | CP-SS | |
| Electromotion mixier | ISO | 23M-R25 | homogenization of tissue |
| TRIZol Reagent | Invitrogen | 15596-026 | the reagent for total RNA extraction |
| DNase I | Takara | 2270A | |
| PrimeScript RT reagent kit | Takara | RR037A | the reagent for reverse transcription |
| SYBR Premix ExTaq II | Takara | RR820A | the reagent for real-time PCR |
| LightCycle 1.2 Instrument | Roche | 12011468001 | the instrument for real-time PCR |
| LightCycle Capillaries (20μl) | Roche | 4929292001 | the material for real-time PCR |
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