Nefrotoxische substantie Micro-injectie in zebravis tot acuut nierfalen Model

Summary

Renal verwondingen opgelopen van nephrotoxins, die drugs, variërend van antibiotica tot chemotherapeutica omvatten, kan leiden tot complexe aandoeningen waarvan de pathogenese blijft onvolledig begrepen. Dit protocol laat zien hoe zebravis kan worden gebruikt voor ziektemodel van deze aandoeningen, die kunnen worden toegepast voor het identificeren van renoprotectieve maatregelen.

Abstract

De nieren zijn gevoelig voor schade door blootstelling aan chemische stoffen ze filteren uit de bloedstroom. Dit kan leiden tot orgaanschade tot een snelle afname van de nierfunctie en de ontwikkeling van klinisch syndroom genoemd acuut nierfalen (AKI). Farmacologische middelen gebruikt medische omstandigheden variërend van bacteriële infectie kanker te behandelen wanneer afzonderlijk toegediend of in combinatie met andere geneesmiddelen, kunnen AKI initiëren. Zebravis een bruikbaar diermodel om chemische effecten op de nierfunctie te bestuderen in vivo, aangezien zij een embryonale nier bestaat uit nefron functionele eenheden die zijn geconserveerd met hogere gewervelde dieren, waaronder mensen. Verder kunnen zebravissen worden toegepast voor genetische en chemische schermen, die mogelijkheden om de cellulaire en moleculaire aspecten van AKI helderen en therapeutische strategieën zoals het identificeren van moleculen nefroprotectief ontwikkelen verschaffen voeren. Hier laten we zien hoe micro-injectie in dezebravisembryo kan worden gebruikt als een paradigma voor nefrotoxische substantie studies.

Introduction

AKI is een abrupt verlies van nierfunctie die kunnen leiden tot verwoestende gevolgen voor de gezondheid ^1. AKI is een belangrijke kwestie in de gezondheidszorg over de hele wereld vanwege de hoge incidentie van ongeveer 20% bij gehospitaliseerde patiënten, met een nog hogere percentages van 30-50% in intensive care gevallen en ouderen, en sterftecijfers van 50-70% ^1-3. Helaas is de prevalentie van AKI is toegenomen en zal naar verwachting verder escaleren de komende tien jaar, mede als gevolg van de diversiteit van de factoren die de AKI kan induceren, die post-operatieve stress, ischemie, en de blootstelling aan nephrotoxins zoals antibiotica en omvatten chemotherapeutica ^4.

AKI gaat plotselinge cellulaire schade in de nier, voorkomende in nefronen, die de wezenlijke functionele elementen zijn en bestaan ​​uit een bloedfilter en een gesegmenteerde tubulus die uitmondt in urine centrale verzamelbuizen ^1. Wanneer een significant aantal nefronenbeschadigd tijdens AKI, de onmiddellijke gevolgen zijn onder andere een onderbreking in de klaring van afval uit de circulatie en verminderd of afgeschaft vloeistofstroom door nefronen wegens obstructie van dode en stervende cellen ^1. Na verloop van tijd kan buisvormige obstructie leiden tot degeneratie van de gehele nefronen, die permanent vermindert de nierfunctie ^1. Fysiologische veranderingen in de nier na AKI omvatten ook complexe inflammatoire gebeurtenissen die kunnen leiden tot chronische littekenvorming ^1.

Ondanks deze resultaten, hebben een aantal nefronen capaciteit om regeneratie te ondergaan na AKI dat de buisvormige epitheel ^5,6 reconstitutes. Hoewel er een toenemende moleculair begrip van nephron regeneratie is geweest, de mechanismen blijven ongrijpbaar in veel opzichten en noodzaken verder onderzoek ^7. De mate waarin AKI tot blijvende nierbeschadiging nog onbekend zijn. Lopend onderzoek suggereert dat de regeneratieve potentieel voor de nieren is dehoogste volgende minder ernstige gevallen van AKI, terwijl meer uitgesproken of herhaalde episodes leiden tot chronische nierziekte (CKD) en uitmonden in eindstadium nierziekte (ESRD) die levensreddende transplantatie of dialyse ^8,9 vereist. Bovendien, mensen die reeds lijden aan CKD zijn op een nog hoger risico op een ernstige episode van AKI ^8,9. Samengevat blijkt dat continue fundamenteel en klinisch onderzoek is cruciaal om te begrijpen, behandelen en voorkomen AKI.

Onderzoek met diermodellen is behulpzaam geweest bij het ​​waarderen van de progressie van de lokale en ecologische veranderingen die optreden tijdens de AKI ¹⁰ geweest. Om dit inzicht te breiden en nieuwe behandelingen te ontwikkelen, heeft de zebravis diermodel toegepast op verschillende manieren ^11,12. De nefronen van de zebravis nier, in zowel het embryo en volwassen, een hoge mate van conservering met zoogdieren ^13-16. Verder nefron epitheliale schade in ZEbrafish lijkt op de werkwijze in hogere vertebraten, waarbij de lokale vernietiging van tubulaire cellen wordt gevolgd door intratubulaire proliferatie en herstel van nefron architectuur ^17-19. In het embryo echter grote tubulus schade van de nephrotoxins zoals cisplatine is gekoppeld letaliteit ^20,21. Ter vergelijking, de zebravis volwassenen overleven AKI en vertonen inhoudelijke regeneratieve mogelijkheden in de nier. Bijvoorbeeld, na blootstelling aan de aminoglycoside antibiotica gentamicine, zebravis regenereren tubulus epitheelbeschadiging en groeien nieuwe nefroneenheden en ^22-24. Hoewel deze gentamicine-geïnduceerde AKI studies waardevolle informatie hebben ontvangen, begrijpen nierschade uit diverse nephrotoxins blijft kritisch voor de werking en de reactie op verschillende soorten schade ²⁵ waarderen.

De zebravis embryo, door zijn omvang, transparantie, en genetische traceerbaarheid, heeft vele voordelen voor de nefrotoxische substantie studies <sup> 25, waarbij de werkwijze van micro-injectie ^20,21 wordt gebruikt om het molecuul (en) voor onderzoek beheren. Nefronen worden gevormd door 24 uur na de bevruchting (HPF) en beginnen om bloed te filteren op ongeveer 48 HPF ^26,27. Dus de snelle vorming en functie van de embryonale nier vergemakkelijkt experimentele analyse. Echter, het proces van micro-injectie heeft technische uitdagingen en er kan een steile leercurve voor het beheersen van de techniek. In deze video artikel beschrijven we hoe de micro-injecties uit te voeren en geven tips voor het oplossen van problemen met het oog op de snelheid van de succesvolle injecties verbeteren.

Protocol

De procedures voor het werken met de zebravis embryo's beschreven in dit protocol werd goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite aan de Universiteit van Notre Dame. 1. Voorbereiding van de Solutions Wordt 50x voorraadoplossing van E3 embryomedium door mengen van 73,0 g NaCl, 3,15 g KCI, 9,15 g CaCl 2 en 9,95 g MgSO 4 in 5 liter gedestilleerd water, en bewaar bij kamertemperatuur. Voor het kweken van zebravis embryo verdunnen 50x voorraadoplossi…

Representative Results

Een micro-injectie station opgezet is voorzien van een stereomicroscoop, micromanipulator en drukregelaar (Figuur 1A). Transilluminatie van de injectieplaat voorkeur om monsters te zien tijdens deze procedure (Figuur 1B). Bereiding van de injectienaald omvat het trekken van de juiste borosilicaatglas, gevolgd door het bereiden van de rand met snijden en tenslotte backloading de naald. Optimaal wordt de naald in plaats schuin dan stomp (figuur 1C)…

Discussion

Een divers aantal therapeutische middelen zijn geassocieerd met AKI ^29. Er zijn aanzienlijke onderzoek vooruitgang in het begrijpen van de schade veroorzaakt door vele afzonderlijke verbindingen, zoals aminoglycoside gentamicine ³⁰ en de gebruikte chemotherapeutische cisplatine ^31,32 geweest. Sommige pathologische veranderingen die betrokken zijn bij deze voorwaarden, blijven echter het onderwerp van lopend onderzoek. Een opkomende uitdaging blijft begrijpen hoe meerdere drugs negatieve …

Materials

Sodium Chloride	American Bioanalytical	AB01915
Potassium Chloride	American Bioanalytical	AB01652
Calcium Chloride	American Bioanalytical	AB00366
N-Phenylthiourea (PTU)	Aldrich Chemistry	P7629
Ethyl 3-aminobenzoate (Tricaine)	Fluka Analytical	A5040
Borosilicate glass	Sutter Instruments Co.	BF100-50-10
Flaming/Brown Micropipette puller	Sutter Instruments Co.	Mo. P097
UltraPure Agarose	Invitrogen	15510-027
Magnesium Sulfate	Sigma-Aldrich	M7506
Methylene Blue	Sigma-Aldrich	M9140
Falcon Diposable Petri Dishes, Sterile, Corning:
60mm x 15mm	VWR	25373-085
100mm x 15mm	VWR	25373-100
(microinjection tray) 150mm x 15mm	VWR	25373-187
Low Temperature Incubator	Fischer Scientific	11 690 516DQ
Micro Dissecting Tweezer	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5010
Micrometer	Ted Pella, Inc.	2280-24