ゼブラフィッシュにおける腎毒素マイクロインジェクションは急性腎障害をモデルに
Summary
抗生物質から化学療法に至るまで薬物が含まnephrotoxinsから発生腎損傷は、その病因が完全には理解のまま、複雑な障害をもたらすことができます。このプロトコルは、ゼブラフィッシュの腎臓保護措置の同定に適用することができ、これらの条件、疾患のモデリングのために使用することができる方法を示します。
Abstract
腎臓は、それらが血流からフィルターの化学物質への曝露から害の影響を受けやすいです。これは、急性腎障害（AKI）として知られている臨床症候群の腎機能と開発の急速な減少に関連した臓器損傷につながることができます。薬剤は、単独または他の薬剤と組み合わせて投与した場合、AKIを開始することができ、細菌感染から癌までの医療状況を治療するために使用されます。ゼブラフィッシュ彼らは人間を含む高等脊椎動物で保存されているネフロン機能単位で構成される胚腎臓を形成するように、in vivoでの腎機能に対する化学的影響を研究するための有用な動物モデルです。さらに、ゼブラフィッシュは、AKIの細胞および分子面を解明し、そのような腎保護分子の同定などの治療戦略を開発するための機会を与える遺伝的および化学的なスクリーニングを行うために利用することができます。ここでは、中にどのようにマイクロインジェクションを実証しますゼブラフィッシュ胚は、腎毒素の研究のためのパラダイムとして利用することができます。
Introduction
AKIは壊滅的な健康影響1につながる可能性が腎臓機能の突然の喪失です。 AKIはさらに高いクリティカルケアの例30〜50％に金利や高齢者、および50から70までパーセント1-3の死亡率で、起因する入院患者のうち、約20％の高い発生率に世界的な重大な医療問題です。残念ながら、AKIの有病率は増加しており、今後10年間でさらにエスカレートすると予測され、一部起因でAKIを誘導することができる要因の多様性、術後ストレス、虚血、および抗生物質などnephrotoxinsへの曝露が含まれると化学療法薬4。
AKIは、一般的に本質的な機能単位であるネフロン、で発生した、腎臓内の急激な細胞の損傷を伴う、および血液フィルタと中央集合管1内に尿を排出セグメント化された尿細管で構成されています。ネフロンのかなりの数がある場合AKI中に破損し、即時の効果は循環からの廃棄物のクリアランスの中断を含み、そして死んだと死細胞1から障害物に起因するネフロンを通る流体の流れを減少または廃止します。時間が経つにつれて、管状閉塞が永久的に腎機能1を減少させる、全体ネフロンの変性につながることができます。 AKI以下の腎臓における生理的な変化はまた、慢性瘢痕1につながることができ、複雑な炎症性事象を伴います。
これらの成果にもかかわらず、ネフロンは、尿細管上皮の5,6を再構成AKI後に再生を受けるためにいくつかの能力を持っています。ネフロン再生の増加分子的理解があったが、メカニズムは多くの点でとらえどころのないままにし、継続的な調査7を必要とします 。 AKIは永久的な腎障害をもたらすの程度も不明のまま。現在の研究は、腎臓のための再生能力がであることを示唆していますより顕著または反復エピソードが慢性腎臓病（CKD）につながり、救命移植または透析8,9を必要とする末期腎疾患（ESRD）に絶頂に達する一方で、最高、AKIの重症度の低い例を以下に示します。また、すでにCKDに罹患している個体は、AKI 8,9の重度のエピソードを収縮のより高い危険にさらされています。まとめると、AKIを、理解し治療および予防するために不可欠である基礎および臨床研究を続けていることは明らかです。
動物モデルでの研究は、AKI 10中に発生する地域や環境変化の進行を鑑賞してきました。この理解を広げるだけでなく、新しい治療法を開発するには、ゼブラフィッシュ動物モデルは、さまざまな方法11,12の様々な使用されています。ゼブラフィッシュ腎臓のネフロンは、胚および成体の両方において、哺乳類13-16と保全の高度を表示します。 ZEでさらに、ネフロン上皮傷害brafishは、尿細管細胞の局所的破壊がネフロンアーキテクチャ17-19の管内増殖および再構築が続いていることにより、高等脊椎動物におけるプロセスに似ています。胚では、しかし、シスプラチンのようなnephrotoxinsから大規模な細管損傷は致死20,21と関連しています。比較すると、ゼブラフィッシュ大人のAKIを生き残るためには、腎臓における実質的な回生機能を発揮します。例えば、アミノグリコシド系抗生物質ゲンタマイシンへの曝露後に、ゼブラフィッシュは、尿細管上皮の損傷を再生成し、新しいネフロン単位だけでなく22-24を成長させます。これらのゲンタマイシン誘発性AKIの研究は、多様なnephrotoxinsから腎障害を理解し、貴重な情報を提供してきたが効果や損傷25の異なるタイプへの応答を理解することが重要で残っています。
その大きさ、透明性、および遺伝的取り扱いやすさのためにゼブラフィッシュの胚は、腎毒素の研究のための多くの利点があります<マイクロインジェクション20,21の方法は、調査のための分子を投与するために使用されるSUP> 25、。ネフロンは、24時間後に受精（HPF）により形成され、約48 HPF 26,27により血液をフィルタリングするために始めています。このように、胚性腎臓の急速な形成と機能は実験的な分析を容易にします。しかし、マイクロインジェクションのプロセスは、技術的な課題があり、技術の習得に急な学習曲線が存在することができます。このビデオの記事では、我々はマイクロインジェクションを行い、成功した注射の速度を高めるために、トラブルシューティングのヒントを提供する方法について説明します。
Protocol
Representative Results
Discussion
治療薬の多様な数はAKI 29と関連しています。アミノグリコシドゲンタマイシン30と広く使われている化学療法シスプラチン31,32のような多くの個々の化合物によって誘発された損傷を理解する上で重要な研究の進歩がありました。これらの条件に関わるいくつかの病理学的変化は、しかし、現在進行中の研究の対象残ります。一つの緊急の課題は、このような重要な医…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、NIHの助成金DP2OD008470によって部分的にサポートされていました。また、RAMはノートルダム大学院の大学によって提供される資金によって部分的にサポートされていました。私たちは、ノートルダム大学で生物科学科、ゼブラフィッシュ研究センター、および幹細胞のためのセンターと再生医療のスタッフに感謝します。我々は、特に腎臓の生物学とこの仕事上での有用なフィードバックについての議論を係合するための研究室のメンバーに感謝します。
Materials
| Sodium Chloride | American Bioanalytical | AB01915 | |
| Potassium Chloride | American Bioanalytical | AB01652 | |
| Calcium Chloride | American Bioanalytical | AB00366 | |
| N-Phenylthiourea (PTU) | Aldrich Chemistry | P7629 | |
| Ethyl 3-aminobenzoate (Tricaine) | Fluka Analytical | A5040 | |
| Borosilicate glass | Sutter Instruments Co. | BF100-50-10 | |
| Flaming/Brown Micropipette puller | Sutter Instruments Co. | Mo. P097 | |
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 15510-027 | |
| Magnesium Sulfate | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| Methylene Blue | Sigma-Aldrich | M9140 | |
| Falcon Diposable Petri Dishes, Sterile, Corning: | |||
| 60mm x 15mm | VWR | 25373-085 | |
| 100mm x 15mm | VWR | 25373-100 | |
| (microinjection tray) 150mm x 15mm | VWR | 25373-187 | |
| Low Temperature Incubator | Fischer Scientific | 11 690 516DQ | |
| Micro Dissecting Tweezer | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5010 | |
| Micrometer | Ted Pella, Inc. | 2280-24 |
References
- Basile, D. P., Anderson, M. D., Sutton, T. A. Pathophysiology of acute kidney injury. Compr. Physiol. 2, 1303-1353 (2012).
- Ostermann, M. Diagnosis of acute kidney injury: kidney disease improving global outcomes criteria and beyond. Curr. Opin. Crit. Care. 20, 581-587 (2014).
- Fluck, R. J. Acute kidney: improving the pathway of care for patients and across healthcare. Curr. Opin. Nephrol. Hypertens. 24, 511-516 (2015).
- Silver, S. A., Cardinal, H., Colwell, K., Burger, D., Dickhout, J. G. Acute kidney injury: preclinical innovations, challenges, and opportunities for translation. Can. J Kidney Health Dis. 2, 30 (2015).
- McCampbell, K. K., Wingert, R. A. Renal stem cells: fact or science fiction?. Biochem. J. 444, 153-168 (2012).
- Li, Y., Wingert, R. A. Regenerative medicine for the kidney: stem cell prospects and challenges. Clin. Transl. Med. 2, 11 (2013).
- Romagani, P., Lasagni, L., Remuzzi, G. Renal progenitors: an evolutionary conserved strategy for kidney regeneration. Nat. Rev. Nephrol. 9, 137-146 (2013).
- Kline, J., Rachoin, J. S. Acute kidney injury and chronic kidney disease: it’s a two-way street. Ren. Fail. 35, 452-455 (2013).
- Chawla, L. S., Kimmel, P. L. Acute kidney injury and chronic kidney disease: an integrated clinical syndrome. Kidney Int. 82, 516-524 (2012).
- Sanz, A. B., Sanchez-Niño, M. D., Martìn-Cleary, C., Ortiz, A., Ramos, A. M. Progress in the development of animal models of acute kidney injury and its impact on drug discovery. Expert Opin. Drug Discov. 8, 879-895 (2013).
- McCampbell, K. K., Wingert, R. A. New tides: using zebrafish to study renal regeneration. Transl Res. 163, 109-122 (2014).
- McKee, R. A., Wingert, R. A. Zebrafish renal pathology: emerging models of acute kidney injury. Curr. Pathobiol. Rep. 3, 171-181 (2015).
- Wingert, R. A., et al. The cdx genes and retinoic acid control the positioning and segmentation of the zebrafish pronephros. PLoS Genet. 3, 1922-1938 (2007).
- Wingert, R. A., Davidson, A. J. The zebrafish pronephros: a model to study nephron segmentation. Kidney Int. 73, 1120-1127 (2008).
- Wingert, R. A., Davidson, A. J. Zebrafish nephrogenesis involves dynamic spatiotemporal expression changes in renal progenitors and essential signals from retinoic acid and irx3b. Dev Dyn. 240, 2011-2027 (2011).
- McCampbell, K. K., Springer, K. N., Wingert, R. A. Analysis of nephron composition and function in the adult zebrafish kidney. J. Vis. Exp. (90), e51644 (2014).
- Johnson, C. S., Holzemer, N. F., Wingert, R. A. Laser ablation of the zebrafish pronephros to study renal epithelial regeneration. J. Vis. Exp. (54), e2845 (2011).
- Palmyre, A., et al. Collective epithelial migration drives kidney repair after acute injury. PLoS One. 9, e101304 (2014).
- Fogelgren, B., et al. Exocyst Sec10 protects renal tubule cells from injury by EGFR/MAPK activation and effects on endocytosis. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 307, F1334-F1341 (2014).
- Hentschel, D. M., Park, K. M., Cilenti, L., Zervox, A. S., Drummond, I. A., Bonventre, J. V. Acute renal failure in zebrafish: a novel system to study a complex disease. Am. J. Physiol. Renal. Physiol. 288, F923-F929 (2005).
- Cosentino, C. C., Roman, B. L., Drummond, I. A., Hukriede, N. A. Intravenous microinjections of zebrafish larvae to study acute kidney injury. J. Vis. Exp. (42), e2079 (2010).
- Zhou, W., Boucher, R. C., Bollig, F., Englert, C., Hildebrandt, F. Characterization of mesonephric development and regeneration using transgenic zebrafish. Am. J. Physiol. Renal. Physiol. 299, F1040-F1047 (2010).
- Diep, C. Q., et al. Identification of adult nephron progenitors capable of kidney regeneration in zebrafish. Nature. 470, 95-101 (2011).
- McCampbell, K. M., Springer, K. N., Wingert, R. A. Atlas of cellular dynamics during zebrafish adult kidney regeneration. Stem Cell Int. , 547636 (2015).
- Sharma, P., Sharma, S., Patial, V., Singh, D., Padwad, Y. S. Zebrafish (Danio rerio): a potential model for nephroprotective drug screening. Clinical Queries: Nephrol. 3, 97-105 (2014).
- Gerlach, G. F., Wingert, R. A. Kidney organogenesis in the zebrafish: insights into vertebrate nephrogenesis and regeneration. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2, 559-585 (2013).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev. Dyn. 203, 253-310 (1995).
- Hanke, N., et al. ‘Zebrafishing’ for novel genes relevant to the glomerular filtration barrier. Biomed. Res. Int. 2013, 658270 (2013).
- Kane-Gill, S. L., Goldstein, S. L. Drug-induced acute kidney injury: a focus on risk assessment for prevention. Crit. Care Clin. 31, 675-684 (2015).
- Lopez-Novoa, J. M., Quiros, Y., Vicente, L., Morales, A. I., Lopez-Hernandez, F. J. New insights into the mechanism of aminoglycoside nephrotoxicity: an integrative point of view. Kidney Int. 79, 33-45 (2010).
- Ozkok, A., Edelstein, C. L. Pathophysiology of cisplatin-induced acute kidney injury. Biomed. Res. Int. 2014, 967826 (2014).
- Perazella, M. A., Moeckel, G. W. Nephrotoxicity from chemotherapeutic agents: clinical manifestations, pathobiology, and prevention/therapy. Semin. Nephrol. 30, 570-581 (2010).
- Cheng, C. N., Verdun, V. A., Wingert, R. A. Recent advances in elucidating the genetic mechanisms of nephrogenesis using zebrafish. Cells. 4, 218-233 (2015).
- Pickart, M. A., Klee, E. W. Zebrafish approaches enhance the translational research tackle box. Transl. Res. 163, 65-78 (2014).
- Cheng, C. N., Li, Y., Marra, A. N., Verdun, V., Wingert, R. A. Flat mount preparation for observation and analysis of zebrafish embryo specimens stained by whole mount in situ hybridization. J. Vis. Exp. (89), e51604 (2014).
- Galloway, J. L., Wingert, R. A., Thisse, C., Thisse, B., Zon, L. I. Combinatorial regulation of novel erythroid gene expression in zebrafish. Exp. Hematol. 36, 424-432 (2008).
- McKee, R., Gerlach, G. F., Jou, J., Cheng, C. N., Wingert, R. A. Temporal and spatial expression of tight junction genes during zebrafish pronephros development. Gene Expr. Patterns. 16, 104-113 (2014).
- Li, Y., Cheng, C. N., Verdun, V. A., Wingert, R. A. Zebrafish nephrogenesis is regulated by interactions between retinoic acid, mecom, and Notch signaling. Dev. Biol. 386, 111-122 (2014).
- Gerlach, G. F., Wingert, R. A. Zebrafish pronephros tubulogenesis and epithelial identity maintenance are reliant on the polarity proteins Prkc iota and zeta. Dev. Biol. 396, 183-200 (2014).
- Cheng, C. N., Wingert, R. A. Nephron proximal tubule patterning and corpuscles of Stannius formation are regulated by the sim1a transcription factor and retinoic acid in the zebrafish. Dev. Biol. 399, 100-116 (2015).
- Lessman, C. A. The developing zebrafish (Danio rerio): A vertebrate model for high-throughput screening of chemical libraries. Birth Defects Res. C Embryo Today. 93, 268-280 (2011).
- Poureetezadi, S. J., Wingert, R. A. Congenital and acute kidney disease: translational research insights from zebrafish chemical genetics. Gen. Med. 1, 112 (2013).
- Poureetezadi, S. J., Donahue, E. K., Wingert, R. A. A manual small molecule screen approaching high-throughput using zebrafish embryos. J. Vis. Exp. (93), e52063 (2014).
- Peng, H. C., Wang, Y. H., Wen, C. C., Wang, W. H., Cheng, C. C., Chen, Y. H. Nephrotoxicity assessments of acetaminophen during zebrafish embryogenesis. Comp. Biochem. Physiol. C Toxicol. Pharmacol. 151, 480-586 (2010).
- Wu, T. S., Yang, J. J., Yu, F. Y., Liu, B. H. Evaluation of nephrotoxic effects of mycotoxins, citrinin and patulin, on zebrafish (Danio rerio) embryos. Food Chem. Toxicol. 50, 4398-4404 (2012).
- Ding, Y. J., Chen, Y. H. Developmental nephrotoxicity of aristolochic acid in a zebrafish model. Toxicol. Appl. Pharmacol. 261, 59-65 (2012).
- Zennaro, C., et al. Podocyte developmental defects caused by adriamycin in zebrafish embryos and larvae: a novel model of glomerular damage. PLoS One. 9, e98131 (2014).
- Ding, Y. J., Sun, C. Y., Wen, C. C., Chen, Y. H. Nephroprotective role of resveratrol and ursolic acid in aristolochic acid intoxicated zebrafish. Toxins. 7, 97-109 (2015).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J. Vis. Exp. (27), e1115 (2009).
- Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos. J. Vis. Exp. (27), e1113 (2009).
- Christou-Savina, S., Beales, P. L., Osborn, D. P. Evaluation of zebrafish kidney function using a fluorescent clearance assay. J. Vis. Exp. (96), e52540 (2015).
