Hormoonverstorende stoffen (EDC) vormen een aanzienlijk risico voor het aquatisch milieu. Gemeentelijke afvalwaterzuiveringsinstallaties zijn belangrijke bijdragen aan de oestrogene potentie van oppervlaktewater. De methodologie in dit document maakt een evaluatie van de doeltreffendheid en de geschiktheid van afvalwaterzuiveringsprocessen opzichte van EDC verwijderd.
Endocrine Disrupting Compounds pose a substantial risk to the aquatic environment. Ethinylestradiol (EE2) and estrone (E1) have recently been included in a watch list of environmental pollutants under the European Water Framework Directive. Municipal wastewater treatment plants are major contributors to the estrogenic potency of surface waters. Much of the estrogenic potency of wastewater treatment plant (WWTP) effluents can be attributed to the discharge of steroid estrogens including estradiol (E2), EE2 and E1 due to incomplete removal of these substances at the treatment plant. An evaluation of the efficacy of wastewater treatment processes requires the quantitative determination of individual substances most often undertaken using chemical analysis methods. Most frequently used methods include Gas Chromatography-Mass Spectrometry (GCMS/MS) or Liquid Chromatography-Mass Spectrometry (LCMS/MS) using multiple reaction monitoring (MRM). Although very useful for regulatory purposes, targeted chemical analysis can only provide data on the compounds (and specific metabolites) monitored. Ecotoxicology methods additionally ensure that any by-products produced or unknown estrogenic compounds present are also assessed via measurement of their biological activity. A number of in vitro bioassays including the Yeast Estrogen Screen (YES) are available to measure the estrogenic activity of wastewater samples. Chemical analysis in conjunction with in vivo and in vitro bioassays provides a useful toolbox for assessment of the efficacy and suitability of wastewater treatment processes with respect to estrogenic endocrine disrupting compounds. This paper utilizes a battery of chemical and ecotoxicology tests to assess conventional, advanced and emerging wastewater treatment processes in laboratory and field studies.
Bezorgdheid over de negatieve effecten van hormoonontregelende stoffen op de natuur reproductieve gezondheid heeft ertoe geleid dat de Europese Unie tot twee oestrogene stoffen (estradiol en ethinylestradiol) te plaatsen op een "watch list" in het kader van de Kaderrichtlijn Water (KRW). EDC omvatten een verscheidenheid aan chemische klassen, met inbegrip van natuurlijke en synthetische steroïde oestrogenen, drugs, pesticiden en industriële chemische stoffen en bestanddelen van consumentenproducten met bekende negatieve gevolgen voor de flora en fauna. Sommige van deze verbindingen kunnen een impact hebben volksgezondheid 1.
Onderzoek heeft aangetoond dat afvalwater van RWZI zijn oestrogene te vissen 2 en als gevolg daarvan veel ontvangende wateren zijn ook oestrogene te vissen 3. Deze werd voor het eerst aangetoond door middel van nationale onderzoeken in het Verenigd Koninkrijk, dat verhoogde concentraties vitellogenin vertoonde (een vrouwelijke specifieke dooier eiwit voorloper 4) in het bloed van de wilde mannelijke vissen en een hoog prewaardigheid van intersex (het ontwikkelen van eieren en / of vrouwelijke reproductieve kanalen in de testis van de mannelijke vissen) in normaal gonochoristic vissoorten 5,6.
Conventionele rioolwaterzuivering is meestal een drie fasen, bestaande uit een eerste screening, gevolgd door primaire en secundaire behandeling die zowel verwijdert opgeloste en gesuspendeerde organische stof. De werkzaamheid van het verwijderen van individuele EDC afhangt van de fysisch-chemische eigenschappen van de stoffen en de effectiviteit van het behandelproces toegepast. Voor veel EDC verwijderen via adsorptie en biologische afbraak kan significant, maar onvolledig zijn. Tertiaire behandeling, zoals zandfiltratie, kunnen effectief zijn bij het verhogen EDC verwijdering 7 dat geavanceerde behandeling met geavanceerde oxidatie (zoals ozon) of actieve kool kan efficiënt om vrijwel volledige verwijdering 7 zijn.
De beoordeling van elke nieuwe technologie voor de behandeling van afvalwater needs de doeltreffendheid van de voorgestelde werkwijze EDC verwijderd bepalen. Een batterij van tests, met inbegrip van gerichte chemische analyse naast ecotoxicologie testen, met behulp van in vivo en in vitro bioassays, biedt uitgebreide gegevens voor dit doel. Hoewel zeer nuttig voor onderzoeksdoeleinden, gerichte chemische analyse alleen gegevens over de verbindingen (en specifieke metabolieten) gecontroleerd. Bioassays toestaan dat de "detectie" van ongunstige effecten van metabolieten en behandeling gegenereerde afvalwater transformatie bijproducten die anders onopgemerkt 8,9. Dit document beschrijft het gebruik van een reeks van chemische en ecotoxiciteit laboratoriumbepalingen om de werkzaamheid van een aantal geavanceerde en opkomende afvalwaterzuiveringsprocessen het verwijderen van de oestrogène potentie van ruwe en behandelde afvalwater en waterlopen beoordelen.
Rioolwaterzuiveringsinstallaties zijn de belangrijkste route van het oppervlaktewater verontreiniging met EDC. Een evaluatie van de doeltreffendheid van de verwijdering van hormonale activiteit van conventionele, geavanceerde of nieuwe behandeling vereist het gebruik van een verscheidenheid van chemische en biologische bepalingen. Chemische analyse met behulp van niet-gerichte en gerichte analyse geeft kwalitatieve of kwantitatieve gegevens over de werkzaamheid van de verwijdering van de afzonderlijke componenten en maakt het dus mogelijk een evaluatie worden gemaakt tegen de kwaliteitsnormen voor het milieu of de voorspelde concentraties zonder effect voor de verbindingen of mengsels van verbindingen geanalyseerd.
Het genereren van omzettingsproducten ontstaan door onvolledige mineralisatie van stoffen na behandeling en de aanwezigheid van ongekende biologisch actieve componenten in afvalwater beperkt de bruikbaarheid van alleen chemische testen. Een combinatie van in vivo en in vitro bioassays in combinatie met analytische chemicusry screening een bruikbare toolbox om de doeltreffendheid van EDC verwijdering bepalen opkomende afvalwaterzuiveringsprocessen. Deze tests, wanneer uitgevoerd naast de traditionele parameters voor de waterkwaliteit en andere toxicologische en microbiologische end-points maken een kritische evaluatie van bestaande en opkomende technologieën voor afvalwaterzuivering.
Het is belangrijk op te merken dat gist gebaseerde oestrogeen schermen (bijv YES) niet alleen in vitro assays oestrogene potentie van chemicaliën en afvalwater bepalen. Een aantal stabiel getransfecteerde zoogdiercellen gebaseerde testen zijn ook ontwikkeld, respectievelijk bijvoorbeeld de ER-CALUX 27 en hERa-HeLa-9903 28 met humane borstkankercellen of cervicale tumorcellen. De JA is vergeleken met soortgelijke zoogdierlijke cellen gebaseerde assays en werd gevonden een vergelijkbaar hoog reproduceerbaar, terecht positieve en negatieve oestrogene ware identificatie rates 29, hoewelugh wordt soms als iets minder gevoelig 27 zijn. Een voordeel van gist gebaseerde reporter assays die in laboratoria zonder aanzienlijke ervaring met zoogdiercelkweek YES gemakkelijker kunnen worden vastgesteld, omdat het minder strenge biologische controlemaatregelen en steriele technieken vereist (YES kan worden uitgevoerd op het tafelblad indien nodig) . De menselijke cellen gebaseerde assays vereisen ook CO 2 incubatoren en luminometers vergeleken met de standaard incubator microplaat lezer gebruikt bij Yes. Twee op basis van gist oestrogeen reporter assays (YES, Saccharomyces cerevisiae en A-YES, Arxula adeninivorans) worden momenteel inter-laboratorium paden voor de validatie van ISO 19040 "Water – Bepaling van de oestrogene potentie van water en afvalwater" aandacht voor de industrie belangstelling voor deze technieken.
Er zijn een aantal beperkingen van de beschreven werkwijzen waarin potentiële vervuiling omvattenvan de monsters tijdens de bemonstering, opslag van monsters en analyse met oestrogene stoffen afkomstig uit het veld of het laboratorium omgeving of door menselijke besmetting (bv weekmakers, oppervlakteactieve stoffen, producten voor persoonlijke verzorging). Dit type verontreiniging in de YES assay (of andere cellen gebaseerde reporter assays) de achtergrond verheffen en beïnvloeden het gebruik van de test. monsters of oplosmiddelen water opgeslagen in plastic flessen kan gemakkelijk leiden tot valse positieven. Valse negatieve punten zijn ook van belang aangezien beide LCMS / MS en de YES assay SPE te verlangen dat oestrogenen concentreren op detecteerbare niveaus. De matrix, de keuze van de SPE sorptiemiddel en elutievloeistof kan de extractie-efficiëntie en de soorten verbindingen uitgewassen beïnvloeden. Met behulp van C18 SPE-cartridges voor de extractie met behulp van de in dit protocol beschreven omstandigheden kan een negatieve bias te genereren, zoals zeer polaire en basische verbindingen slecht zouden worden bewaard door het sorptiemiddel. Bovendien is dit protocol vereist reconstructie van de geëlueerde YES eluent van methaanol tot ethanol door indampen aan funder stikstof resulteert in het verlies van vluchtige stoffen droog. Daardoor kan het protocol bieden onderschat oestrogene werkzaamheid van de geteste monsters. Deze beperkingen zijn vooral van belang bij het overwegen van de YES-assay als onbekende of onverwachte verbindingen zouden kunnen worden gemist, omdat ze niet zijn gehaald of ze zijn verloren als gevolg van verdamping. Bovendien LCMS / MS techniek maakt gebruik van gelabelde interne standaarden om te corrigeren voor herstel; Deze benadering kan niet worden gebruikt met de YES assay.
Significante beperkingen van de vivo testen van afvalwater zijn de hoge kosten en de tijd die nodig is voor de beoordeling opzichte van in vitro werkwijzen. Momenteel is het gebruik van visembryo proeven oestrogene te detecteren beperkt. Toch is er enig succes met het produceren van oestrogeen reagerende transgene gloeiende vis embryo's 30, die toekomstige toepassingen zou kunnen zijn geweest. Fathead minnows (die in deze protocol) zijn een gemeenschappelijke laboratoriumdieren en VTG inductie bij mannetjesvissen is een goed gedocumenteerde biomerker van oestrogene blootstelling en een kwantificeerbare maat voor afvalwater effluent oestrogeniciteit 22 of andere oestrogene verbindingen of mengsels 31. OESO-richtlijnen voor hormoonontregelaars zijn gevalideerd met behulp van volwassen dikkopjes, Japans medaka en zebravis 32,33, met VTG zijnde een gevoelige biomarker van blootstelling aan oestrogenen in alle drie soorten. Echter VTG inductie niet direct correleren voortplantingsschade en derhalve de ecologische gevolgen van blootstelling afvalwater, zoals gezien bij ernstig interseks voorn 3. Aan de andere kant, voorn zijn geen klassieke 'laboratorium soorten' voor ecotoxicologie onderzoek vanwege hun grote omvang, lange generatie tijd (2-3 jaar tot seksuele rijpheid te bereiken), reproductieve stijl; groep spawning (fok) vindt eenmaal per jaar, en de moeilijkheid om mannetjes van vrouwtjes (anders dan tijdens identificerenhet paaiseizoen). Echter, dit normaliter gonochoristic soort is zeer goed bestudeerd in het Verenigd Koninkrijk, vanwege de ontdekking dat stroomafwaarts van oestrogene afvalwatereffluent, mannetjesvissen vertoonden verstoringen hun endocrinologie (bijv aanwezigheid van vrouwelijke-specifieke vitellogenine in het bloed) en histopathologie (ovotestes – ontwikkeling van eieren in de testis en / of vrouwelijke reproductieve kanalen) 5,6. Daarom, als een toekomstige toepassing van deze protocollen, voorn (of vergelijkbare soorten) kan een nuttig wilde sentinel soorten om te laten zien als echte verbeteringen afvalwater kwaliteit (en minder oestrogeniciteit) worden gezien in rivieren ontvangen van geavanceerde behandeld afvalwater. Ze kunnen ook worden toegepast bij het einde van leidingsystemen technologisch verbeterde afvalwater van proefschaal planten 7 volgen. Bij het overwegen van welke soorten om te gebruiken in in vivo afvalwater evaluaties is er een afruil tussen de relatief snelle en gecontroleerde testen met behulp van laboratorium soorten ten opzichte van delanger veld gebaseerd, maar meer voor het milieu relevante, het testen van het gebruik van inheemse soorten. Echter, zoals in vivo evaluaties zijn hoge kosten en mag alleen worden beschouwd als de laatste set van tests die na evaluaties met behulp van chemische analyse en in vitro testen.
Kritische stappen in de beschreven protocollen omvatten de voorbereiding en behandeling van monsters en glaswerk (dat wil zeggen, flessen en monstername-apparatuur moet worden voorbehandeld met geschikte oppervlakte-actieve reinigingsmiddel) om besmetting van de monsters van milieuverontreinigende stoffen, ook contact opnemen monsters te beperken met kunststof en vermijd andere materialen die valse positieven produceren. Dit is even belangrijk bij het ontwerpen en bouwen van aquaria en vis blootstelling systemen. Idealiter aquaria (huisvesting voorraden en tijdens blootstelling) moet worden opgebouwd uit materialen met een lage adsorptie 32 met minimale risico besmetting. Roestvast staal kan worden gebruikt voor het effluent of water opslagtanks.Overwegende dat de tanks van een glazen constructie hebben de voorkeur voor aquaria (omdat dit biedt ook gemakkelijke observatie van de vis). Het gebruik van lage graad kunststof pijpen of buizen moeten worden vermeden 32, 34 PVC en ABS kan gebruikt worden als 'goed gekruid, dwz, links voor uitlogen verontreinigingen in stromend verdunningswater ten minste 12 uur vóór gebruik. Medische kwaliteit siliconen slang is met succes toegepast in onze faciliteit voor peristaltische pomp levering van chemicaliën en afvalwater / verdunning water tanks. Evenals overweegt oestrogene verontreiniging in de bouw en het uitvoeren van de waterdieren systeem, is het ook belangrijk om na te denken over de voeding van de vis; veel fatsoen vis voedingsmiddelen zijn gevonden oestrogene om vis te zijn. Het is daarom belangrijk om alle voedingsmiddelen te testen op activiteit (bijvoorbeeld in de gist Oestrogeen scherm bekijken Beresford et al. 14) voorafgaand aan het gebruik ervan in dit soort onderzoeken.
Probleemoplossenvan de chemische analyse of YES assay protocollen beschreven wordt vereenvoudigd als kwaliteitsgarantie monsters waaronder meerdere reizen, laboratorium en oplosmiddel blanks worden geanalyseerd, naast positieve controles en echte steekproeven om vals positieve en vals negatieve resultaten te elimineren. Positieve (bijvoorbeeld EE2) en negatieve (verdunningswater) met controle moet ook altijd worden gebruikt in de in vivo assays voor gevoeligheid verwachte biologische biomarker of eindpunt (dwz VTG of histopathologie) te bevestigen, en laat onverwachte verontreinigingen te detecteren ( bijvoorbeeld van experimentele set-up, dieet, of verdunning wateren). Eventuele wijzigingen in het protocol moet voorafgaand aan het verrichten van alle studies worden gevalideerd.
Met een striktere regulering van oestrogene stoffen in het milieu terecht via RWZI afvalwater is voorzien dat effectiever afvalwaterbehandeling technologieën zullen moeten worden ontwikkeld. De batterij van de in dit manuscript beschreven tests compliment van deecotoxicologische en chemische evaluatie testen gewoonlijk worden toegepast op afvalwaterzuiveringsinstallatie lozingen. Daarom toekomstige toepassing van dit soort holistische batterij van de test in staat moet stellen het afvalwater technologie-ontwikkelaars en exploitanten, om de meest ecologisch verantwoord ontwerpen rekening houdend met de beste methoden om zowel de specifieke gereguleerde oestrogene stoffen en de totale biologische activiteit te verwijderen uit te voeren.
The authors have nothing to disclose.
Projects presented in this paper were funded by Severn Trent Water and Brunel University London. The authors would like to thank Alan Henshaw and John Churchley for providing field and laboratory assistance. T.J.C. thanks the Heinz Endowments for support. M.R.M. thanks the Steinbrenner Institute for a Steinbrenner Doctoral Fellowship and Carnegie Mellon University for a Presidential Fellowship.
Wellwash Versa plate washer | Thermo Scientific | 5165010 | |
Plate reader | Molecular Devices | SpectraMax 340PC | |
Incubator | Memmert | INB 400 | 37oC incubation required for carp assay |
Fisherbrand whirlimixer | Fisher Scientific | 13214789 | |
Icemaker | Scotsman | AF80 | |
12-Channel F1 digital multichannel pipette | Thermo Scientific Finnpipette | 4661070 | |
ELISA kits | Biosense Laboratories | V01018401-096 (Fathead minnow) V01003402-096 (Carp) |
|
Microfuge tubes, 0.5ml | Alpha labs | LW2372 | |
Microfuge tubes, 1.5ml | Alpha labs | LW2375 | |
Sulphuric acid, 95-98% | Sigma-Aldrich | 258105 | |
Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Histology | |||
Tissue processor | Leica Biosystems | TP1020 | |
Wax dispenser | Thermo Scientific Raymond Lamb | E66HC | |
Metal embedding mold | Leica Biosystems | Various | |
Hot plate | Thermo Scientific Shandon | 3120063 | |
Cold plate (EG1150 C) | Leica Biosystems | 14038838037 | |
Heated forceps (EG F) | Leica Biosystems | 14038835824 | |
Microtome | Leica Biosystems | RM2235 | |
Paraffin section floatation bath | Electrothermal | MH8517 | |
Slide drying bench | Electrothermal | MH6616 | |
Stainmate automated stainer | Thermo Scientific Shandon | E103/S10L | |
Cassettes, Histosette II, biopsy | Simport | M493 | |
Paraffin wax | Thermo Scientific Raymond Lamb | W1 | |
Histo-Clear II | National Diagnostics | HS-202 | |
IMS (ethanol mix), IDA99 | Tennants | ID440 | |
Polysine adhesion slides | Thermo Scientific Gerhard Menzel | J2800AMNZ | |
Cover slips, 22x50mm | VWR | 631-0137 | |
Histomount | National Diagnostics | HS-103 | |
Haematoxylin Harris GURR | VWR | 351945S | |
Eosin, 1%, aqueous | Pyramid Inovation | S20007-E | |
Fisherbrand slide boxes | Fisher Scientific | 11701486 | |
Microtome blades, MB35 | Thermo Scientific Shandon | 3050835 | |
Bouin’s solution | Sigma Aldrich | HT10132-1L | |
Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Yeast screen | |||
Flow cabinet | Labcaire Systems Ltd | SC12R | |
Cooled incubator | LMS Cooled Incubator | 303 | |
Incubator | Memmert | INB 400 | |
Shaker | Grant | PSU-10i | |
Fisherbrand whirlimixer | Fisher Scientific | 13214789 | |
Plate shaker | Heidolph Titramax 100 | 544-11200-00 | |
12-Channel F1 digital multichannel pipette | Thermo Scientific Finnpipette | 4661070 | |
12-channel pipette, electronic | Sartorius | 735441 | |
96-well flat-bottom microplates | MP Biomedicals Thermo Scientific Nunc Sarstedt |
76-232-05 260860 82.1581.001 |
We have found that these multiwell plates all produce low backgrounds |
HPLC grade water | Rathburn | RH1020 | |
Absolute ethanol | Hayman Kimia | F200238 | |
Potassium phosphate monobasic anhydrous | Sigma-Aldrich | P-5655 | |
Ammonium sulphate | Sigma-Aldrich | A-2939 | |
Potassium hydroxide, pellets | Sigma-Aldrich | P-1767 | |
Magnesium sulfate, anhydrous | Sigma-Aldrich | M-2643 | |
Iron (III) sulfate | Sigma-Aldrich | 307718 | |
L-Leucine | Sigma-Aldrich | L-8912 | |
L-Histidine | Sigma-Aldrich | H-6034 | |
Adenine | Sigma-Aldrich | A-2786 | |
L-Argenine, hydrochloride | Sigma-Aldrich | A-6969 | |
L-Methionine | Sigma-Aldrich | M-5308 | |
L-Tyrosine | Sigma-Aldrich | T-8566 | |
L-Isoleucine | Sigma-Aldrich | I-7403 | |
L-Lysine, hydrochloride | Sigma-Aldrich | L-8662 | |
L-Phenylalanine | Sigma-Aldrich | P-5482 | |
L-Glutamic acid | Sigma-Aldrich | G-8415 | |
L-Valine | Sigma-Aldrich | V-0513 | |
L-Serine | Sigma-Aldrich | S-4311 | |
Thiamine, hydrochloride | Sigma-Aldrich | T-1270 | |
Pyridoxine | Sigma-Aldrich | P-5669 | |
D-Pantothenic acid, hemicalcium salt | Sigma-Aldrich | P-5155 | |
Inositol | Sigma-Aldrich | I-5125 | |
d-Biotin | Sigma-Aldrich | B-4639 | |
D-(+)-Glucose anhydrous; mixed anomers | Sigma-Aldrich | G-7021 | |
L-Aspartic acid | Sigma-Aldrich | A-4534 | |
L-Threonine | Sigma-Aldrich | T-8441 | |
Copper (II) sulfate, anhydrous | Sigma-Aldrich | C-1297 | |
Chlorophenolred-b-D galactopyranoside (CPRG) | Sigma-Aldrich | 10884308001 | |
Glycerol | Sigma-Aldrich | G-2025 | |
17 β-Estradiol | Sigma-Aldrich | E-8875 | |
Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Steroids | |||
Acetone | Rathburn | ||
Acetonitrile | Rathburn | ||
Ammonia solution | Rathburn | ||
Ethylacetate | Rathburn | ||
Copper(II) nitrate. | Sigma-Aldrich | ||
Acetone | Rathburn | ||
Dichloromethane | Rathburn | ||
2, 4, 16, 16-d4-17b-estradiol | CDN Isotopes | ||
2, 4, 16, 16-d4-estrone | CDN Isotopes | ||
2, 4, 16, 16-d4-17a-ethynyl oestradiol. | CDN Isotopes | ||
17b-estradiol | Sigma-Aldrich | ||
Estrone | Sigma-Aldrich | ||
17a-ethynyl oestradiol. | Sigma-Aldrich | ||
Hexane | Rathburn | ||
Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | ||
Methanol | Sigma-Aldrich | ||
Sodium hydrogen carbonate | Sigma-Aldrich | ||
Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | ||
Styrene divinyl benzene cartridge (Isolute ENV+) solid phase extraction cartridge (200 mg/6 ml) | Biotage | ||
Isolute aminopropyl solid phase extraction cartridge (500 mg/6 ml) | Biotage | ||
Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Fish study | |||
orange-white silicon manifold tubing 0.63 bore pk 6 | watson marlow | 982.0063.000 | |
straight connectors for 0.5/0.8 bore pk 20 | watson marlow | 999.2008.000 | |
pumsil silicon tubing 0.8 bore 15m | watson marlow | 913.A008.016 | |
200 series multi-channel persitaltic pump | watson marlow | 205CA | |
Silicone tubing x15m (dosing tanks) | vwr | SFM1-3250 | |
silicone tubing x 15m (large for inflow/outflow) | vwr | SFM1-5450 | |
2.5L glass winchester pk 4 | Fisher Scienctific | BTF-505-050B | |
magnetic stir bar 51x8mm pk 10 | Fisher Scienctific | FB55595 | |
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (MS222) | sigma aldrich | E10521-10G | |
17α-Ethynylestradiol | sigma aldrich | E4876-100MG | |
Absolute ethanol | Hayman Kimia | F200238 | |
Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
SPE | |||
1/8 inch PTFE tubes 'straws' colour coded pk4 | sigma aldrich | 57276 | |
disposable liners for manifold | sigma aldrich | 57059 | |
filtration tubes without frits 6ml pk 30 | sigma aldrich | 57242 | |
reservior adaptors pk 12 | sigma aldrich | 57020-U | |
stainless steel weight for manifold pk 4 | sigma aldrich | 57278 | |
male luer plug for manifold pk12 | sigma aldrich | 504351 | |
SPE Vacuum Manifold | sigma aldrich | 57265 | |
stop cocks for extraction mainfold (supelco) pk 12 | waters | WAT054806 | |
Sep-Pak Plus C18 cartridge box 50 | waters | WAT020515 | |
Methanol HPLC grade 2.5L | fisher scientific | M/4056/17 | |
7ml glass vials with lids (58x17mm) pk 399 | fisher scientific | TUL-520-031K | |
Absolute ethanol | Hayman Kimia | F200238 | |
vacuum pump e.g. VP Series Vacuum Pump | Camlab | 1136915 |