Aislamiento de Perivasculares Multipotentes poblaciones de células precursoras de Cardíaca Tejido humano

Summary

tejido cardíaco humano alberga poblaciones de células precursoras multipotentes perivasculares que pueden ser adecuados para la regeneración miocárdica. La técnica descrita aquí permite el aislamiento simultáneo y purificación de dos poblaciones de células estromales multipotentes asociados con vasos nativos sangre, es decir CD146 ⁺ CD34 ^– pericitos y CD34 ⁺ CD146 ^– células adventicias, desde el miocardio humano.

Abstract

Multipotent mesenchymal stem/stromal cells (MSC) were conventionally isolated, through their plastic adherence, from primary tissue digests whilst their anatomical tissue location remained unclear. The recent discovery of defined perivascular and MSC cell marker expression by perivascular cells in multiple tissues by our group and other researchers has provided an opportunity to prospectively isolate and purify specific homogenous subpopulations of multipotent perivascular precursor cells. We have previously demonstrated the use of fluorescent activated cell sorting (FACS) to purify microvascular CD146⁺CD34^– pericytes and vascular CD34⁺CD146^– adventitial cells from human skeletal muscle. Herein we describe a method to simultaneously isolate these two perivascular cell subsets from human myocardium by FACS, based on the expression of a defined set of cell surface markers for positive and negative selections. This method thus makes available two specific subpopulations of multipotent cardiac MSC-like precursor cells for use in basic research and/or therapeutic investigations.

Introduction

El corazón ha sido considerado como un órgano de post-mitótico. Sin embargo, estudios recientes han demostrado la presencia de la facturación de los cardiomiocitos limitada en los corazones humanos adultos ^1. Las células madre / progenitoras nativas con potencial de diferenciación de los cardiomiocitos también se han identificado dentro del miocardio en roedores adultos y los corazones humanos, incluyendo Sca-1 ^+, c-kit ^+, cardioesfera formando, y, más recientemente, las células precursoras perivasculares ^2,3. Estas células representan candidatos atractivos para las terapias dirigidas a la mejora cardiaca reparación / regeneración a través de trasplante de células o la estimulación de la proliferación in-situ.

Mesenquimales madre / células del estroma (MSC) se han aislado a partir de casi todos los tejidos humanos ^4,5 Los ensayos clínicos de las aplicaciones terapéuticas de MSC se han llevado a cabo para varias condiciones patológicas tales como la reparación cardiovascular ^6, del injerto contra el anfitrión de la enfermedad ⁷ </sup>, Y la cirrosis hepática ^8. Los efectos beneficiosos se han atribuido a la capacidad de las MSC a: el hogar de los sitios de inflamación ^9; diferenciarse en diferentes tipos de células ^10; secretar moléculas pro-reparadoras ^11; y modular respuestas inmunes del huésped ^12. El aislamiento de las MSC se ha basado tradicionalmente en su adhesión preferencial a los sustratos de plástico. Sin embargo, la población resultante de células es típicamente marcadamente heterogénea ^13. Mediante el uso de células activadas por fluorescencia (FACS) con una combinación de marcadores de células perivasculares clave, hemos sido capaces de aislar y purificar una población precursor MSC-como multipotentes (CD146 ⁺ / CD31 ^– / CD34 ^– / CD45 ^– / CD56 ^-) a partir de múltiples tejidos humanos, incluyendo adultos músculo esquelético y la grasa blanca ^14.

poblaciones de células perivasculares en varios tejidos no cardíacos han demostrado tener propiedades madre / células progenitoras unand están siendo investigados para su uso clínico en el ajuste cardiovascular. Pericitos, uno de los más conocidos de los subconjuntos de células perivasculares, son una población heterogénea que juegan varios papeles fisiopatológicos incluidos en el desarrollo de nuevos vasos ^15, la regulación de la presión arterial ^16, y el mantenimiento de la integridad vascular ^17,18. Como se muestra en múltiples tejidos, subconjuntos específicos de pericitos de forma nativa expresan antígenos MSC y sostener sus fenotipos MSC-como en cultivo primario después de la purificación FACS ^14. Por otra parte, estas células establemente mantienen sus fenotipos largo plazo dentro de la cultura y exhiben potencial de diferenciación multi-linaje, similar a las MSC ^19,20. Estos resultados sugieren que los pericitos son uno de los orígenes de la MSC ¹⁴ difícil de alcanzar. El potencial terapéutico de los pericitos se ha demostrado con una reducción en la cicatrización del miocardio y mejorar la función cardíaca después de un trasplante en lesionado por isquemia²¹ corazones. Recientemente, nos purifica con éxito pericitos del miocardio humano y demostrar sus fenotipos MSC-como múltiple y capacidad (adipogénesis, condrogénesis y osteogénesis) con la ausencia de la miogénesis esquelético ^3. Además, los pericitos miocardio exhibieron diferenciales capacidades potenciales y angiogénicos cardiomiogénico en comparación con sus homólogos purificados a partir de otros órganos.

Una segunda población de células madre / progenitoras multipotentes perivasculares, la célula de la adventicia, se ha aislado de las venas safena humana sobre la base de la expresión de CD34 positivo ^22. Células adventicias venosos han demostrado tener un potencial clonogénico, capacidad de diferenciación mesodérmica y el potencial proangiogénico in vitro. El trasplante de estas células en los corazones lesionados por isquemia de los ratones resultó en una reducción en la fibrosis intersticial, un aumento de la angiogénesis y el flujo sanguíneo miocárdico, la reducción de dil ventricularación, y el aumento de la fracción de eyección cardíaca ^23. Curiosamente, se ha demostrado que células adventicias adiposas a perder la expresión de CD34 y regular al alza la expresión de CD146 en cultivo en respuesta al tratamiento angiopoyetina II, lo que sugiere la adopción de un fenotipo de pericitos con la estimulación ^24. Dentro del corazón, sin embargo, la población de células de la adventicia todavía no se ha purificado de forma prospectiva por FACS y / o bien caracterizado. Utilizando los procedimientos de aislamiento de células que se describen en las siguientes secciones, actualmente estamos caracterizando células adventicias miocardio e investigar su potencial para aplicaciones regenerativas.

Aquí se describe un método para aislar y purificar dos subpoblaciones de células madre / progenitoras perivasculares de miocardio fetal o adulto humano. Este método de aislamiento de células prospectivo permitirá a los investigadores para obtener subconjuntos de células madre / progenitoras perivasculares isogénicas de biopsias cardíacas humanas para estudios comparativos y further explorar su potencial terapéutico en diversas condiciones patológicas cardíacas.

Protocol

1. Tratamiento de la Muestra cardiaca humana Asegúrese de que todos los fluidos, contenedores, los instrumentos y el área operativa dedicada son estériles. Coloque la muestra de tejido cardíaco (adquiridos por el banco de tejidos, equipo quirúrgico) en el medio de almacenamiento se compone del medio refrigerado por Dulbecco modificado de Eagle (DMEM) que contiene 20% de suero fetal bovino (FBS) y 1% de penicilina-estreptomicina (P / S) en el hielo para el transporte 3. Reti…

Representative Results

Las células individuales se distinguen de escombros y dobletes sobre la base de dispersión frontal y lateral distribuciones. Las células vivas fueron identificados por su incapacidad para asumir el tinte DAPI. La estrategia gating fue elegido sobre la base de etiquetado de control de isotipo de este vivo, la disociación de células enteras cardíaca (Figura 1). A partir de las células vivas, las células CD45 + fueron cerrada primero, seguido de CD56 <sup…

Discussion

aumento de la evidencia apoya una limitada capacidad de regeneración del corazón humano adulto después de la lesión. Identificación y caracterización de células precursoras nativas responsables de tales respuestas regenerativas en los corazones lesionados son fundamentales tanto para la comprensión de los mecanismos y vías de señalización asociadas y el desarrollo de métodos para utilizar estas células terapéuticamente.

Protocolos anteriores han descrito el aislamiento de los s…

Materials

AbC Anti-mouse Bead Kit	Molecular Probes	A-10344
Collagenase I	Gibco	17100-017	Reconstitute powder as required and filter sterilise
Collagenase II	Gibco	17101-015
Collagenase IV	Gibco	17104-019
anti-human CD34-PE	BD Pharmingen	555822	Keep sterile
anti-human CD45-APC-Cy7	BD Pharmingen	557833	Keep sterile
anti-human CD56-PE-Cy7	BD Pharmingen	557747	Keep sterile
anti-human CD144-PerCP-Cy5.5	BD Pharmingen	561566	Keep sterile
anti-human CD146-AF647	AbD Serotec	MCA2141A647	Keep sterile
EGM2-BulletKit	Lonza	CC-3162	For collection of cells and culture until adhered
DMEM, high glucose, GlutaMAX without sodium pyruvate	ThermoFischer Scientific	10566-016
Fetal Bovine Serum	ThermoFischer Scientific	10500-064	Freeze in aliquots and keep sterile
Gelatin	Sigma Aldrich	G1393	Dilute with sterile water
IgG1k-PE	BD Pharmingen	559320	Keep sterile
IgG1k-APC-Cy7	BD Pharmingen	557873	Keep sterile
IgG1k-PE-Cy7	BD Pharmingen	557872	Keep sterile
IgG1k-PerCP-Cy5.5	BD Pharmingen	561566	Keep sterile
IgG1k-647	AbD Serotec	MCA1209A647	Keep sterile
Mouse serum	Sigma Aldrich	M5905	Keep sterile
Paraffin Film – Parafilm M	Sigma Aldrich	P7793
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15979-063	Freeze in aliquots and keep sterile
Phosphate buffered saline pH 7.4	ThermoFischer Scientific	10010-023	Keep sterile
Red Blood Cell Lysing Buffer Hybri-Max	Sigma Aldrich	R7757	Keep sterile
Trypan Blue Solution	Sigma Aldrich	T8154
Trypsin-EDTA 0.5%(10X)	Invitrogen	15400-054
FACSARIA FUSION	BD Pharmingen		Fluorescence Activated Cell Sorter