Automatisert lipid bilaget Membran Dannelse Ved hjelp av en Polydimethylsiloxane Thin Film
Summary
Vi viser en lagringsdyktig, transportable lipid bilaget formasjonssystem. En lipid dobbeltlag-membranen kan dannes i løpet av 1 time med over 80% suksessrate når en frossen membranforløperen bringes til omgivelsestemperatur. Dette systemet vil redusere arbeidskrevende prosesser og kompetanse knyttet til ionekanaler.
Abstract
En kunstig lipid bilaget, eller svart lipid membran (BLM), er et kraftig verktøy for å studere ionekanaler og proteininteraksjoner, så vel som for biosensor anvendelser. Men konvensjonelle BLM dannelsesteknikker har flere ulemper, og de ofte krever spesifikk kompetanse og arbeidskrevende prosesser. Spesielt vanlige BLMs lider av lave formasjons suksess priser og inkonsekvent membrandannelse tid. Her viser vi en storable og transportable BLM formasjonssystem med kontrollert uttynnings tid og forbedret BLM dannelseshastigheten ved å erstatte konvensjonelt brukte filmer (polytetrafluoretylen, polyoksymetylen, polystyren) til polydimethylsiloxane (PDMS). I dette forsøk er en porøs strukturert polymer, slik som PDMS tynn film anvendes. I tillegg, i motsetning til konvensjonelt anvendte løsningsmidler med lav viskositet, bruk av squalen tillates en kontrollert uttynnings tid via langsom oppløsningsmiddel absorpsjon av PDMS, forlenge levetiden membran. i annonsendition, ved anvendelse av en blanding av skvalen og heksadekan, frysepunktet for lipidoppløsningen ble øket (~ 16 ° C), i tillegg er membranforløpere ble produsert som kan lagres på ubestemt tid og lett kan transporteres. Disse membran forløpere har redusert BLM dannelse tiden av <1 time og oppnådde en BLM dannelse hastighet på ~ 80%. Videre har ionekanal eksperimenter med gramicidin A demonstrert muligheten for membransystemet.
Introduction
Kunstig lipid bilaget membran, eller svart lipid membran (BLM), er et viktig verktøy for å belyse mekanismene for cellemembraner og ionekanaler, samt for å forstå samspillet mellom ionekanaler og ioner / molekyler. 1-7 Selv om patch-clamp-metoden blir ofte regnet som gullstandarden for cellemembran studier, er det arbeidskrevende og krever høyt kvalifiserte operatører for ionekanal målinger. 8 Mens kunstig utblandede lipidbllag membraner har dukket opp som alternative verktøy for ionekanal studier, 9,10 de er også forbundet med strevsom prosesser og spesifikk kompetanse. Videre membraner er utsatt for mekaniske forstyrrelser. Derfor har lipidbilag teknologier introduseres dato begrensede praktiske anvendelser. 11
For å øke robusthet og lang levetid på lipidbllag membraner, Costello et al. 12, og Ide og Yanagida <sup> 13 har utviklet en frittstående lipid bilaget støttet av hydrogeler. Til tross for økt levetid men (<24 timer), ble bilags robusthet ikke forbedret. Jeon et al., 14 utformet en hydrogel innkapslet membran (HEM) med intim hydrogel-lipid bilaget kontakt, noe som resulterer i forbedret levetid (opp til flere dager). For ytterligere å øke levetiden til HEM, Malmstadt og Jeon et al. Opprettet en hydrogel-innkapslet membran med hydrogel-lipid binding via in-situ kovalent konjugering (cgHEM). 15 I begge systemer, øket membranlevetider i hovedsaken (> 10 dager) . Men membranformasjons systemene var ikke tilstrekkelig robust, og kunne ikke lagres eller leveres der det er nødvendig for å frigjøre kompetanse for bruk av lipidbilagene.
Utviklingen av et lipidbilag plattformen har først og fremst dreid seg om å øke robusthet og lang levetid på BLMs. Selv lang av BLMs har vært substantially forbedret nylig, har sine søknader vært begrenset på grunn av manglende mobilitet og ability. For å overvinne disse problemene, Jeon et al. Opprettet en storable membran system og innførte en membran forløper (MP). 16 Å konstruere en MP, de forberedt en blanding av n- dekan og heksa inneholder 3% DPhPC (1,2-diphytanoyl- sn -glycero-3-fosfatidylcholin) for å styre frysepunktet til lipidoppløsningen, slik at det ville fryse ved ~ 14 ° C (under romtemperatur, over typiske kjøleskapstemperatur). I dette forsøk ble MP spredt over en liten åpning på et polytetrafluoretylen (PTFE) film og deretter frosset i et kjøleskap ved 4 ° C. Når MP ble brakt til romtemperatur, MP tint og et lipidbilag som automatisk ble dannet, noe som eliminerer ekspertise vanligvis forbundet med membrandannelsen. Men suksessen rate av BLM laget fra MP var så lav som ~ 27%, og membran formation gang var inkonsekvent (30 min til 24 timer), noe som begrenser dens praktiske anvendelser.
I denne studien er et polydimetylsiloksan (PDMS) tynn film som brukes i stedet for en vanlig hydrofobe tynne filmer (PTFE, polyoksymetylen, polystyren) til (a) kontroll fabrikasjon tid og (b) øke suksessraten av BLM formasjon som tidligere rapportert av Ryu et al. 17 Heri membrandannelsen ble forenklet ved ekstraksjon av oppløsningsmidler på grunn av den porøse natur av PDMS, og den tid som kreves for membrandannelse ble vellykket kontrollert i denne studien. I dette system, som lipidoppløsningen ble absorbert inn i PDMS tynn film, ble en konsistent membrandannelsen tid oppnådd. Dessuten ble membran levetid forlenges på grunn av langsom absorpsjon av løsningsmidler inn i de PDMS tynn film, et resultat av tilsetningen av squalen til lipidoppløsningen. Vi gjennomførte optiske og elektriske målinger for å verifisere at membraner dannet ved hjelp av denne teknikken er passende for ipå kanaler studier.
Protocol
Representative Results
Discussion
Our BLM formation technique provides a powerful tool for cell membrane and ion channel studies, in contrast to conventional techniques that have limited potential for industrial use. We developed a membrane precursor using a PDMS thin film, and devised a frozen membrane precursor with expedited self-assembly.
As opposed to conventional membrane formation methods with hydrophobic films, where membrane formation only occurs via surface interactions between the film and the lipid solution,20…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Pioneer Research Center Program (NRF-2012-0009575) and National Research Foundation Grants (NRF-2012R1A1B4002413, NRF-2014R1A1A2059341) from the National Research Foundation of Korea. This work was also partially supported by the Inha University Research Grant.
Materials
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P9333 | For buffer solution |
| Tris-hydrochloride | Sigma-Aldrich | 1185-53-1 | For buffer solution |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich | 60-00-4 | For buffer solution |
| n-decane | Sigma-Aldrich | 44074-U | For lipid solution |
| Hexadecane | Sigma-Aldrich | 544-76-3 | For lipid solution |
| Squalene | Sigma-Aldrich | S3626 | For lipid solution |
| Gramicidin A | Sigma-Aldrich | 11029-61-1 | Membrane protein |
| 1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine | Avanti Polar Lipids, Inc. | 850356 | For membrae formation |
| Sylgard 184a and 184b elastromer kit | Dow Corning Asia | To produce PDMS thin film | |
| 0.2 μm filter | Satorius stedim | 16534———-K | To filter buffer solution |
| Rotator | FinePCR | AG | To dissolve lipid homogeneously |
| Autoclave | Biofree | BF-60AC | To sterilize buffer solution |
| Spin coater | Shinu Mst | SP-60P | To spread PDMS prepolymer |
| Vaccum dessiccator | Welch | 2042-22 | To remove air bubble in PDMS prepolymer |
| 500 μm punch | Harris Uni-Core | 0.5 | To create an aperture on the PDMS thin film |
| CNC machine | SME trading | SME 2518 | To fabricate membrane formation chamber |
| Halogen fiber optic illuminator | Motic | MLC-150C | To illuminate the aperture of PDMS thin film for optical observation |
| Digital microscope | Digital blue | QX-5 | To optically observe lipid bilayer membrane formation |
| Electrode | A-M Systems | To electrically observe membrane formation | |
| Microelectrode amplifier (Axopatch amplifier) | Axon Instruments | Axopatch 200B Amplifier | To measure capacitance of the membrane (described as microelectrode amplifier in the manuscript) |
References
- Hanke, W., Schulue, W. . Planar lipid bilayers: methods and applications. , (2012).
- Mirzabekov, T. A., Silberstein, A. Y., Kagan, B. L. Use of planar lipid bilayer membranes for rapid screening of membrane active compounds. Methods Enzymol. 294, 661-674 (1999).
- Bayley, H., Cremer, P. S. Stochastic sensors inspired by biology. Nature. 413 (6852), 226-230 (2001).
- Fang, Y., Lahiri, J., Picard, L. G protein-coupled receptor microarrays for drug discovery. Drug. Discov. Today. 8 (16), 755-761 (2003).
- Majd, S., et al. Applications of biological pores in nanomedicine, sensing, and nanoelectronics. Curr. Opin. Biotechnol. 21 (4), 439-476 (2010).
- Kim, Y. R., et al. Synthetic Biomimetic Membranes and Their Sensor Applications. Sensors (Basel). 12 (7), 9530-9550 (2012).
- Ryu, H., et al. Investigation of Ion Channel Activities of Gramicidin A in the Presence of Ionic Liquids Using Model Cell Membranes. Sci Rep. 5, (2015).
- Wood, C., Williams, C., Waldron, G. J. Patch clamping by numbers. Drug. Discov. Today. 9 (10), 434-441 (2004).
- Mueller, P., Rudin, D. O., Tien, H. T., Wescott, W. C. Reconstitution of cell membrane structure in vitro and its transformation into an excitable system. Nature. 194, 979-980 (1962).
- Montal, M., Mueller, P. Formation of bimolecular membranes from lipid monolayers and a study of their electrical properties. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 69, 3561-3566 (1972).
- Baaken, G., Sondermann, M., Schlemmer, C., Ruhe, J., Behrends, J. C. Planar microelectrode-cavity array for high-resolution and parallel electrical recording of membrane ionic currents. Lab Chip. 8 (6), 938-944 (2008).
- Costello, R., Peterson, I., Heptinstall, J., Byrne, N., Miller, L. A robust gel-bilayer channel biosensor. Adv. Mater. Opt. Electron. 8 (2), 47-52 (1998).
- Ide, T., Yanagida, T. An artificial lipid bilayer formed on an agarose-coated glass for simultaneous electrical and optical measurement of single ion channels. Biochem. Biophys. Res. Commun. 265 (2), 595-599 (1999).
- Jeon, T. J., Malmstadt, N., Schmidt, J. J. Hydrogel-encapsulated lipid membranes. J Am Chem Soc. 128 (1), 42-43 (2006).
- Malmstadt, N., Jeon, T. J., Schmidt, J. J. Long-Lived Planar Lipid Bilayer Membranes Anchored to an In Situ Polymerized Hydrogel. Adv. Mater. 20 (1), 84-89 (2008).
- Jeon, T. J., Poulos, J. L., Schmidt, J. J. Long-term storable and shippable lipid bilayer membrane platform. Lab. Chip. 8 (10), 1742-1744 (2008).
- Ryu, H., et al. Automated Lipid Membrane Formation Using a Polydimethylsiloxane Film for Ion Channel Measurements. Anal. Chem. 86 (18), 8910-8915 (2014).
- Yaws, C. . Chemical Properties Handbooks: Physical, Thermodynamic, Environmental, Transport, Safety, and Health Related Properties for Organic and Inorganic Chemicals. , (1999).
- Windholz, M., Budavari, S., Stroumtsos, L. Y., Fertig, M. N. . The Merck index. An encyclopedia of chemicals and drugs. , (1976).
- Miller, C. . Ion Channel Reconstitution. , (1986).
- Miller, C. Open-state substructure of single chloride channels from Torpedo electroplax. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 299 (1097), 401-411 (1982).
- Benz, R., Frohlich, O., Lauger, P., Montal, M. Electrical capacity of black lipid films and of lipid bilayers made from monolayers. Biochim. Biophys. Acta. 394 (3), 323-334 (1975).
- Priel, A., Gil, Z., Moy, V. T., Magleby, K. L., Silberberg, S. D. Ionic requirements for membrane-glass adhesion and giga seal formation in patch-clamp recording. Biophys. J. 92 (11), 3893-3900 (2007).
