Automatiserad lipidbiskiktmembranet bildning med användning av en Polydimetylsiloxan Thin Film
Summary
Vi visar en lagringsbara, transportabla lipiddubbelskikt bildningen. En lipidbiskiktmembranet kan bildas inom en timme med över 80% framgång när en frusen membran prekursor bringas till omgivande temperatur. Detta system kommer att minska arbetskrävande processer och expertis i samband med jonkanaler.
Abstract
En konstgjord lipidbiskikt, eller svart lipidmembran (BLM), är ett kraftfullt verktyg för att studera jonkanaler och proteininteraktioner, liksom för biosensorapplikationer. konventionella BLM bildningstekniker har dock flera nackdelar och de kräver ofta särskild sakkunskap och mödosamma processer. I synnerhet konventionella BLMs lider låga bildnings framgångsrika och inkonsekvent membranbildning tid. Här visar vi en lagringsbar och trans BLM bildningen med kontrollerad gallring Tiden och förbättrad BLM bildningshastigheten genom att ersätta konventionellt använda filmer (polytetrafluoretylen, polyoximetylen, polystyren) till polydimetylsiloxan (PDMS). I detta experiment är en porös strukturerad polymer såsom PDMS tunn film används. Dessutom, i motsats till konventionellt använda lösningsmedel med låg viskositet, användningen av skvalen tillåts en kontrollerad gallring Tiden via långsam lösningsmedel absorption av PDMS, förlänger membran livstid. i adsättning, genom att använda en blandning av skvalen och hexadekan, fryspunkten för lipidlösningen ökades (~ 16 ° C), dessutom har membran prekursorer fram som kan obestämd tid lagras och lätt transporteras. Dessa membran prekursorer har minskat BLM bildning tid av <1 timme och uppnått en BLM bildningshastigheten av ~ 80%. Dessutom jonkanal experiment med gramicidin A visade genomförbarheten av membransystem.
Introduction
Artificiell lipidbiskiktmembranet eller svart lipidmembran (BLM), är ett viktigt verktyg för att belysa mekanismerna för cellmembran och jonkanaler, liksom för att förstå samspelet mellan jonkanaler och joner / molekyler. 1-7 Även om patch-clamp-metoden anses ofta vara den gyllene standarden för cellmembranstudier, är det arbetskrävande och kräver mycket skickliga operatörer för jonkanal mätningar. 8 även artificiellt rekonstituerade lipidbiskiktmembraner har dykt upp som alternativa verktyg för jonkanal studier, 9,10 de också förknippade med mödosam processer samt specifik kunskap. Dessutom membran är känsliga för mekaniska störningar. Därför har lipiddubbelskikt teknik som introduceras hittills begränsade praktiska tillämpningar. 11
För att förbättra robustheten och livslängden av lipidbiskiktmembraner, Costello et al. 12, och Ide och Yanagida <sup> 13 har utarbetat en fristående lipiddubbelskikt stöds av hydrogeler. Trots förbättrad livslängd dock (<24 timmar), var två skikt robusthet inte förbättrats. Et al. Jeon 14 utarbetat en hydrogel inkapslad membran (HEM) med intim hydrogel-lipiddubbelskikt kontakt, vilket resulterar i förbättrad livslängd (upp till flera dagar). För att ytterligare öka livslängden på HEM, Malmstadt och Jeon et al. Skapade en hydrogel-inkapslad membran med hydrogel-lipid bindning via in situ kovalent konjugering (cgHEM). 15 I båda systemen, membran livslängd ökat kraftigt (> 10 dagar) . Men membranbildningssystemen var inte tillräckligt robust, och kan inte lagras eller levereras där så krävs för att befria expertis för användning av lipiddubbelskikt.
Utvecklingen av ett lipiddubbelskikt plattform har främst kretsat kring ökad robusthet och livslängd BLMs. Även livslängden för BLMs har varit substantially förbättras senare tid har sina ansökningar varit begränsad på grund av bristande flyttbarhet och lagringsbarhet. För att övervinna dessa problem, Jeon et al. Skapade en lagringsbar membransystem och introducerade ett membran föregångare (MP). 16 För att konstruera en MP, de förberett en blandning av n- dekan och hexadekan innehållande 3% DPhPC (1,2-diphytanoyl- sn-glycero-3-fosfatidylkolin) för att reglera fryspunkten för lipidlösningen sådana att det skulle frysa vid ~ 14 ° C (under rumstemperatur, ovanför typisk kylskåpstemperatur). I detta experiment var kombi spridda över en liten öppning på en polytetrafluoretylen (PTFE) -film och därefter fryses i ett kylskåp vid 4 ° C. När MP fördes till rumstemperatur tinade MP och ett lipiddubbelskikt var automatiskt bildas, vilket eliminerar expertis vanligtvis förknippas med membranbildning. Men var så låg som ~ 27%, och membran formatio framgång på BLM göras från MPn tid var inkonsekvent (30 min till 24 h), vilket begränsar dess praktiska tillämpningar.
I denna studie, är en polydimetylsiloxan (PDMS) tunn film som används i stället för en konventionell hydrofoba tunna filmer (PTFE, polyoximetylen, polystyren) och (a) Kontroll tillverkningstiden och (b) öka andelen framgångsrika BLM formation som tidigare rapporterats av Ryu et al. 17 Häri ades membranbildning underlättas genom extraktion av lösningsmedel på grund av den porösa naturen hos PDMS, och den tid som krävs för membranbildning lyckades kontrollerad i denna studie. I detta system, som lipidlösningen absorberades i PDMS tunn film, var ett konsekvent membranbildning tid uppnåtts. Dessutom har membran livslängd förlängs på grund av långsam absorption av lösningsmedel i PDMS tunnfilms, ett resultat av tillsatsen av skvalen till lipidlösningen. Vi har utfört optiska och elektriska mätningar för att kontrollera att membran bildade med denna teknik är lämplig för ipå kanaler studier.
Protocol
Representative Results
Discussion
Our BLM formation technique provides a powerful tool for cell membrane and ion channel studies, in contrast to conventional techniques that have limited potential for industrial use. We developed a membrane precursor using a PDMS thin film, and devised a frozen membrane precursor with expedited self-assembly.
As opposed to conventional membrane formation methods with hydrophobic films, where membrane formation only occurs via surface interactions between the film and the lipid solution,20…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Pioneer Research Center Program (NRF-2012-0009575) and National Research Foundation Grants (NRF-2012R1A1B4002413, NRF-2014R1A1A2059341) from the National Research Foundation of Korea. This work was also partially supported by the Inha University Research Grant.
Materials
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P9333 | For buffer solution |
| Tris-hydrochloride | Sigma-Aldrich | 1185-53-1 | For buffer solution |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich | 60-00-4 | For buffer solution |
| n-decane | Sigma-Aldrich | 44074-U | For lipid solution |
| Hexadecane | Sigma-Aldrich | 544-76-3 | For lipid solution |
| Squalene | Sigma-Aldrich | S3626 | For lipid solution |
| Gramicidin A | Sigma-Aldrich | 11029-61-1 | Membrane protein |
| 1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine | Avanti Polar Lipids, Inc. | 850356 | For membrae formation |
| Sylgard 184a and 184b elastromer kit | Dow Corning Asia | To produce PDMS thin film | |
| 0.2 μm filter | Satorius stedim | 16534———-K | To filter buffer solution |
| Rotator | FinePCR | AG | To dissolve lipid homogeneously |
| Autoclave | Biofree | BF-60AC | To sterilize buffer solution |
| Spin coater | Shinu Mst | SP-60P | To spread PDMS prepolymer |
| Vaccum dessiccator | Welch | 2042-22 | To remove air bubble in PDMS prepolymer |
| 500 μm punch | Harris Uni-Core | 0.5 | To create an aperture on the PDMS thin film |
| CNC machine | SME trading | SME 2518 | To fabricate membrane formation chamber |
| Halogen fiber optic illuminator | Motic | MLC-150C | To illuminate the aperture of PDMS thin film for optical observation |
| Digital microscope | Digital blue | QX-5 | To optically observe lipid bilayer membrane formation |
| Electrode | A-M Systems | To electrically observe membrane formation | |
| Microelectrode amplifier (Axopatch amplifier) | Axon Instruments | Axopatch 200B Amplifier | To measure capacitance of the membrane (described as microelectrode amplifier in the manuscript) |
References
- Hanke, W., Schulue, W. . Planar lipid bilayers: methods and applications. , (2012).
- Mirzabekov, T. A., Silberstein, A. Y., Kagan, B. L. Use of planar lipid bilayer membranes for rapid screening of membrane active compounds. Methods Enzymol. 294, 661-674 (1999).
- Bayley, H., Cremer, P. S. Stochastic sensors inspired by biology. Nature. 413 (6852), 226-230 (2001).
- Fang, Y., Lahiri, J., Picard, L. G protein-coupled receptor microarrays for drug discovery. Drug. Discov. Today. 8 (16), 755-761 (2003).
- Majd, S., et al. Applications of biological pores in nanomedicine, sensing, and nanoelectronics. Curr. Opin. Biotechnol. 21 (4), 439-476 (2010).
- Kim, Y. R., et al. Synthetic Biomimetic Membranes and Their Sensor Applications. Sensors (Basel). 12 (7), 9530-9550 (2012).
- Ryu, H., et al. Investigation of Ion Channel Activities of Gramicidin A in the Presence of Ionic Liquids Using Model Cell Membranes. Sci Rep. 5, (2015).
- Wood, C., Williams, C., Waldron, G. J. Patch clamping by numbers. Drug. Discov. Today. 9 (10), 434-441 (2004).
- Mueller, P., Rudin, D. O., Tien, H. T., Wescott, W. C. Reconstitution of cell membrane structure in vitro and its transformation into an excitable system. Nature. 194, 979-980 (1962).
- Montal, M., Mueller, P. Formation of bimolecular membranes from lipid monolayers and a study of their electrical properties. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 69, 3561-3566 (1972).
- Baaken, G., Sondermann, M., Schlemmer, C., Ruhe, J., Behrends, J. C. Planar microelectrode-cavity array for high-resolution and parallel electrical recording of membrane ionic currents. Lab Chip. 8 (6), 938-944 (2008).
- Costello, R., Peterson, I., Heptinstall, J., Byrne, N., Miller, L. A robust gel-bilayer channel biosensor. Adv. Mater. Opt. Electron. 8 (2), 47-52 (1998).
- Ide, T., Yanagida, T. An artificial lipid bilayer formed on an agarose-coated glass for simultaneous electrical and optical measurement of single ion channels. Biochem. Biophys. Res. Commun. 265 (2), 595-599 (1999).
- Jeon, T. J., Malmstadt, N., Schmidt, J. J. Hydrogel-encapsulated lipid membranes. J Am Chem Soc. 128 (1), 42-43 (2006).
- Malmstadt, N., Jeon, T. J., Schmidt, J. J. Long-Lived Planar Lipid Bilayer Membranes Anchored to an In Situ Polymerized Hydrogel. Adv. Mater. 20 (1), 84-89 (2008).
- Jeon, T. J., Poulos, J. L., Schmidt, J. J. Long-term storable and shippable lipid bilayer membrane platform. Lab. Chip. 8 (10), 1742-1744 (2008).
- Ryu, H., et al. Automated Lipid Membrane Formation Using a Polydimethylsiloxane Film for Ion Channel Measurements. Anal. Chem. 86 (18), 8910-8915 (2014).
- Yaws, C. . Chemical Properties Handbooks: Physical, Thermodynamic, Environmental, Transport, Safety, and Health Related Properties for Organic and Inorganic Chemicals. , (1999).
- Windholz, M., Budavari, S., Stroumtsos, L. Y., Fertig, M. N. . The Merck index. An encyclopedia of chemicals and drugs. , (1976).
- Miller, C. . Ion Channel Reconstitution. , (1986).
- Miller, C. Open-state substructure of single chloride channels from Torpedo electroplax. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 299 (1097), 401-411 (1982).
- Benz, R., Frohlich, O., Lauger, P., Montal, M. Electrical capacity of black lipid films and of lipid bilayers made from monolayers. Biochim. Biophys. Acta. 394 (3), 323-334 (1975).
- Priel, A., Gil, Z., Moy, V. T., Magleby, K. L., Silberberg, S. D. Ionic requirements for membrane-glass adhesion and giga seal formation in patch-clamp recording. Biophys. J. 92 (11), 3893-3900 (2007).
