Bir polidimetilsiloksan İnce Film Kullanarak Otomatik çift katlı lipid Membran Oluşumu
Summary
Bir depolanabilir, taşınabilir lipit iki katmanlı oluşum sistemi göstermektedir. Dondurulmuş bir membran ön-madde çevre sıcaklığına getirildiğinde bir lipid iki-tabakalı zar üzerinden% 80 başarı oranı ile 1 saat içinde oluşturulabilmektedir. Bu sistem iyon kanalları ile ilişkili zahmetli süreçler ve uzmanlık azaltacaktır.
Abstract
Yapay bir lipit iki tabakalı ya da siyah lipid membran (BLM), iyon kanalları ve protein etkileşimleri incelemek, hem de biyosensör uygulamaları için çok güçlü bir araçtır. Ancak, geleneksel BLM oluşum teknikleri çeşitli dezavantajları var ve onlar genellikle belirli uzmanlık ve zahmetli süreçler gerektirir. Özellikle, geleneksel BLMs düşük oluşum başarı oranları ve tutarsız membran oluşumu zaman muzdarip. Burada, polidimetilsiloksan (PDMS) geleneksel olarak kullanılan filmler (politetrafloroetilen, polioksimetilen, polistren) değiştirerek kontrol inceltme çıkış süresi ve gelişmiş BLM oluşum hızı ile depolanabilir ve taşınabilir BLM oluşum sistemini göstermektedir. Bu deneyde, örneğin PDMS ince film gibi bir gözenekli yapılı bir polimer kullanılır. Düşük viskoziteli geleneksel olarak kullanılan çözücülere karşı ek olarak, skualenin kullanımı membran ömrünü uzatan PDMS yavaş çözücü emmesi ile kontrollü bir incelme Çıkış zaman izin. Reklamdakoşul, skualen ve heksadekan bir karışımını kullanarak, lipit çözeltisinin donma noktası süresiz olarak saklanabilir ve kolayca taşınabilir, membran ön üretilmiştir Buna ek olarak, (~ 16 ° C) arttırıldı. Bu zar öncüleri <1 saat BLM oluşumu süresini azalttı ve% 80 ~ bir BLM oluşum oranı elde ettik. Ayrıca, gramicidin A iyon kanal deneyleri membran sisteminin uygulanabilirliğini göstermiştir.
Introduction
Yapay çift katlı lipid membran ya da siyah lipid membran (BLM), hücre zarlarının ve iyon kanalları, mekanizmaların tanıtılması yanı sıra iyon kanalları ve iyonlar / molekülleri arasındaki etkileşimleri anlamak için önemli bir araçtır. Patch-kelepçe yönteminin rağmen 1-7 genellikle hücre zarı çalışmaları için altın standart olarak kabul edilir, bu zahmetli ve iyon kanal ölçümleri için çok yetenekli operatörleri gerektirir. 8 yapay yeniden çift katlı lipid membranlar iyon kanal çalışmaları için alternatif bir araç olarak ortaya çıkmıştır ederken, 9,10 onlar da zahmetli ile ilişkili süreçler ve özel uzmanlık. Ayrıca, membranlar mekanik tedirginlikler hassastırlar. Bu nedenle, bugüne kadar sunulan çift katlı lipid teknolojileri sınırlı pratik uygulamalar. 11
Çift katlı lipid membranlar Costello ve ark. 12 ve Ide ve Yanagida sağlamlığını ve uzun ömürlü artırmak amacıyla <sup> 13 hidrojeller tarafından desteklenen bir serbest duran lipid çift geliştirdiler. Ancak gelişmiş uzun ömürlü olmasına rağmen (<24 saat), iki tabakalı sağlamlığı gelişmiş değildi. Jeon ve ark., 14 (birkaç güne kadar) artmış uzun ömürlü sonuçlanan samimi hidrojel çift katlı lipid kişiyle hidrojel kapsüllü membran (HEM) tasarladı. Daha HEM ömrünü arttırmak için, Malmstadt ve Jeon ve ark., Hidrojel lipit Her iki sistemde de yerinde kovalent konjugasyon (cgHEM). 15 ile bağlama ile bir hidrojel kapsüllenmiş zar oluşturulur, membran ömürleri önemli ölçüde artmıştır (> 10 gün) . Ancak, membran oluşumu sistemleri yeterince güçlü değildi ve lipit bilayers kullanımı için uzmanlık kurtarmak için gerektiğinde depolanan veya teslim edilemedi.
bir lipid iki tabakalı platformunun geliştirilmesi öncelikle sağlamlığı ve BLMs uzun ömürlü etrafında dönüyordu etti. BLMs uzun ömürlü su olmasına rağmenbstantially gelişmiş son uygulamaları nedeniyle taşınabilirliği ve depolanamaması eksikliği sınırlı kalmıştır. Bu sorunları aşmak için, Jeon ve ark., Bir depolanabilir membran sistemi oluşturdu ve MP oluşturmak için bir membran öncüsü (MP). 16 tanıttı, onlar% 3 DPhPC (1,2-diphytanoyl- içeren n dekan ve heksadekan karışımı hazırladı SN -glisero-3-fosfatidilkolin) o ~ 14 ° C (oda sıcaklığının altında tipik soğutma sıcaklığının üstünde) dondurulması öyle ki, lipid çözeltisinin donma noktası kontrol edilebilir. Bu deneyde, MP politetrafloroetilen (PTFE), filmin küçük bir diyafram üzerinde yayılır ve daha sonra 4 ° C'de bir buzdolabı içinde dondurulmuştur. MP oda sıcaklığına getirildi, MP eritildi ve bir lipid iki katmanlı de otomatik olarak membran oluşumu ile bağlantılı uzmanlık ortadan oluşturulmuştur. Ancak, MP yapılan BLM başarı oranı ~% 27, ve membran Formatio gibi düşük oldun zaman, (30 dk saat 24) tutarsız pratik uygulamalarını sınırlayan.
Daha önce Ryu tarafından bildirilen bu çalışmada, bir polidimetilsiloksan (PDMS) ince film yerine (a) kontrol üretim süresi ve (b) BLM oluşum başarı oranını arttırmak için geleneksel bir hidrofobik ince filmler (PTFE, polioksimetilen, polistren) arasında kullanılır ve ark., 17, burada, hücre formasyonu nedeniyle PDMS gözenekli doğası çözücü ekstraksiyonu ile kolaylaştırılır, ve zar oluşumu için gerekli zaman başarılı bir şekilde bu çalışmada kontrol edilmiştir. Lipid çözeltisi PDMS ince film absorbe gibi bu sistemde, tutarlı bir membran oluşumu süresi elde edildi. Ayrıca, membran süresi nedeniyle PDMS ince film, yağ çözeltisine skualen ilavesinin bir sonucu olarak çözücülerin yavaş bir emme uzatılmıştır. Biz bu tekniği kullanarak oluşturulan membranlar i için uygun olduğunu doğrulamak için optik ve elektrik ölçümleri yapılmıştırkanal çalışmaları.
Protocol
Representative Results
Discussion
Our BLM formation technique provides a powerful tool for cell membrane and ion channel studies, in contrast to conventional techniques that have limited potential for industrial use. We developed a membrane precursor using a PDMS thin film, and devised a frozen membrane precursor with expedited self-assembly.
As opposed to conventional membrane formation methods with hydrophobic films, where membrane formation only occurs via surface interactions between the film and the lipid solution,20…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Pioneer Research Center Program (NRF-2012-0009575) and National Research Foundation Grants (NRF-2012R1A1B4002413, NRF-2014R1A1A2059341) from the National Research Foundation of Korea. This work was also partially supported by the Inha University Research Grant.
Materials
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P9333 | For buffer solution |
| Tris-hydrochloride | Sigma-Aldrich | 1185-53-1 | For buffer solution |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich | 60-00-4 | For buffer solution |
| n-decane | Sigma-Aldrich | 44074-U | For lipid solution |
| Hexadecane | Sigma-Aldrich | 544-76-3 | For lipid solution |
| Squalene | Sigma-Aldrich | S3626 | For lipid solution |
| Gramicidin A | Sigma-Aldrich | 11029-61-1 | Membrane protein |
| 1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine | Avanti Polar Lipids, Inc. | 850356 | For membrae formation |
| Sylgard 184a and 184b elastromer kit | Dow Corning Asia | To produce PDMS thin film | |
| 0.2 μm filter | Satorius stedim | 16534———-K | To filter buffer solution |
| Rotator | FinePCR | AG | To dissolve lipid homogeneously |
| Autoclave | Biofree | BF-60AC | To sterilize buffer solution |
| Spin coater | Shinu Mst | SP-60P | To spread PDMS prepolymer |
| Vaccum dessiccator | Welch | 2042-22 | To remove air bubble in PDMS prepolymer |
| 500 μm punch | Harris Uni-Core | 0.5 | To create an aperture on the PDMS thin film |
| CNC machine | SME trading | SME 2518 | To fabricate membrane formation chamber |
| Halogen fiber optic illuminator | Motic | MLC-150C | To illuminate the aperture of PDMS thin film for optical observation |
| Digital microscope | Digital blue | QX-5 | To optically observe lipid bilayer membrane formation |
| Electrode | A-M Systems | To electrically observe membrane formation | |
| Microelectrode amplifier (Axopatch amplifier) | Axon Instruments | Axopatch 200B Amplifier | To measure capacitance of the membrane (described as microelectrode amplifier in the manuscript) |
References
- Hanke, W., Schulue, W. . Planar lipid bilayers: methods and applications. , (2012).
- Mirzabekov, T. A., Silberstein, A. Y., Kagan, B. L. Use of planar lipid bilayer membranes for rapid screening of membrane active compounds. Methods Enzymol. 294, 661-674 (1999).
- Bayley, H., Cremer, P. S. Stochastic sensors inspired by biology. Nature. 413 (6852), 226-230 (2001).
- Fang, Y., Lahiri, J., Picard, L. G protein-coupled receptor microarrays for drug discovery. Drug. Discov. Today. 8 (16), 755-761 (2003).
- Majd, S., et al. Applications of biological pores in nanomedicine, sensing, and nanoelectronics. Curr. Opin. Biotechnol. 21 (4), 439-476 (2010).
- Kim, Y. R., et al. Synthetic Biomimetic Membranes and Their Sensor Applications. Sensors (Basel). 12 (7), 9530-9550 (2012).
- Ryu, H., et al. Investigation of Ion Channel Activities of Gramicidin A in the Presence of Ionic Liquids Using Model Cell Membranes. Sci Rep. 5, (2015).
- Wood, C., Williams, C., Waldron, G. J. Patch clamping by numbers. Drug. Discov. Today. 9 (10), 434-441 (2004).
- Mueller, P., Rudin, D. O., Tien, H. T., Wescott, W. C. Reconstitution of cell membrane structure in vitro and its transformation into an excitable system. Nature. 194, 979-980 (1962).
- Montal, M., Mueller, P. Formation of bimolecular membranes from lipid monolayers and a study of their electrical properties. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 69, 3561-3566 (1972).
- Baaken, G., Sondermann, M., Schlemmer, C., Ruhe, J., Behrends, J. C. Planar microelectrode-cavity array for high-resolution and parallel electrical recording of membrane ionic currents. Lab Chip. 8 (6), 938-944 (2008).
- Costello, R., Peterson, I., Heptinstall, J., Byrne, N., Miller, L. A robust gel-bilayer channel biosensor. Adv. Mater. Opt. Electron. 8 (2), 47-52 (1998).
- Ide, T., Yanagida, T. An artificial lipid bilayer formed on an agarose-coated glass for simultaneous electrical and optical measurement of single ion channels. Biochem. Biophys. Res. Commun. 265 (2), 595-599 (1999).
- Jeon, T. J., Malmstadt, N., Schmidt, J. J. Hydrogel-encapsulated lipid membranes. J Am Chem Soc. 128 (1), 42-43 (2006).
- Malmstadt, N., Jeon, T. J., Schmidt, J. J. Long-Lived Planar Lipid Bilayer Membranes Anchored to an In Situ Polymerized Hydrogel. Adv. Mater. 20 (1), 84-89 (2008).
- Jeon, T. J., Poulos, J. L., Schmidt, J. J. Long-term storable and shippable lipid bilayer membrane platform. Lab. Chip. 8 (10), 1742-1744 (2008).
- Ryu, H., et al. Automated Lipid Membrane Formation Using a Polydimethylsiloxane Film for Ion Channel Measurements. Anal. Chem. 86 (18), 8910-8915 (2014).
- Yaws, C. . Chemical Properties Handbooks: Physical, Thermodynamic, Environmental, Transport, Safety, and Health Related Properties for Organic and Inorganic Chemicals. , (1999).
- Windholz, M., Budavari, S., Stroumtsos, L. Y., Fertig, M. N. . The Merck index. An encyclopedia of chemicals and drugs. , (1976).
- Miller, C. . Ion Channel Reconstitution. , (1986).
- Miller, C. Open-state substructure of single chloride channels from Torpedo electroplax. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 299 (1097), 401-411 (1982).
- Benz, R., Frohlich, O., Lauger, P., Montal, M. Electrical capacity of black lipid films and of lipid bilayers made from monolayers. Biochim. Biophys. Acta. 394 (3), 323-334 (1975).
- Priel, A., Gil, Z., Moy, V. T., Magleby, K. L., Silberberg, S. D. Ionic requirements for membrane-glass adhesion and giga seal formation in patch-clamp recording. Biophys. J. 92 (11), 3893-3900 (2007).
