Xenoinjertos de tumores humanos son vascularizado y infiltrada por células de origen de ratón durante la fase de crecimiento in vivo. Para evitar el sesgo causado por estas células contaminantes durante el análisis de aguas abajo, hemos desarrollado un método que permite el agotamiento completo de todas las células de ratón mediante clasificación celular magnética.
El uso de modelos de líneas celulares in vitro para la investigación del cáncer ha sido una herramienta útil. Sin embargo, se ha demostrado que estos modelos no para imitar de forma fiable los tumores de pacientes en diferentes ensayos 1. Xenoinjertos de tumores humanos representan el estándar de oro en relación con la biología del tumor, el descubrimiento de fármacos, y la investigación de metástasis 2-4. Xenoinjertos de tumores se pueden derivar de diferentes tipos de material como líneas de células tumorales, tejido tumoral de tumores de pacientes primarios de 4 o tumores en serie trasplantados. Cuando se propagan in vivo, el tejido xenoinjertado se infiltra y vascularizada por las células de origen murino. Múltiples factores tales como la entidad tumor, el origen del material xenoinjertado, tasa de crecimiento y la región de trasplante influyen en la composición y la cantidad de células de ratón presentes en xenoinjertos tumorales. Sin embargo, incluso cuando estos factores se mantienen constantes, el grado de contaminación de células de ratón es muy variable.
Contaminating células de ratón deterioran significativamente análisis aguas abajo de xenoinjertos de tumores humanos. Como fibroblastos de ratón muestran eficacias de alta chapado y las tasas de proliferación, tienden a crecer demasiado cultivos de células tumorales humanas, especialmente la proliferación de las subpoblaciones lentamente. De células de ratón deriva de ADN, ARNm y proteínas componentes pueden sesgar el análisis de la expresión génica aguas abajo, la secuenciación de próxima generación, así como el análisis del proteoma 5. Para superar estas limitaciones, hemos desarrollado un método rápido y fácil de aislar las células tumorales humanas vírgenes de tejido tumoral xenoinjertado. Este procedimiento se basa en el agotamiento completo de las células de origen de ratón mediante la combinación de la disociación de tejido automatizado con el disociador tejido benchtop y clasificación de células magnético. Aquí, demostramos que las células diana humanas pueden ser puede ser obtenido con el grado de pureza mayor que 96% en menos de 20 min independiente del tipo de tumor.
tumores humanos sólidos consisten en fisiológica múltiple, así como tipos de células neoplásicas. Ellos forman tejidos heterogéneos con estructuras biológicas complejas. Los procesos biológicos como la formación del tumor, la progresión y las respuestas hacia terapias aún no se comprenden totalmente. Modelos in vitro de cultivos celulares de representan una herramienta útil para estudiar y comprender la biología del tumor. Sin embargo, sólo pueden reflejar en parte estructuras y procesos que se encuentran en los tejidos tumorales. Modelos de tumores humanos preclínicos fiables y estables son un requisito previo para el desarrollo de fármacos anti-tumorales y terapias 4,6, así como para la comprensión de la biología del tumor y la interacción de células tumorales y su entorno.
Modelos de xenoinjerto de tumor humano derivadas de tumores primarios de pacientes muestran altas relaciones con el tejido de origen en relación con la arquitectura histológica, las interacciones con las estructuras micro-ambientales, potencial metastásico y las respuestas a los fármacos 7 </sup>. Incluso cuando xenoinjertos de tumor se derivan de las células cultivadas o líneas celulares que se asemejan más a tumores de pacientes, por lo tanto mostrando mayor validez en la mayoría de los ensayos de comparación con los modelos de cultivo celular in vitro. Estas características los convierten en el estándar de oro de los modelos preclínicos 4 hacen. Además de su aplicación en la investigación del cáncer, el xenotrasplante de células humanas en ratones también se utiliza con frecuencia en la investigación de células madre para determinar el potencial stemness y diferenciación de una población objetivo 8.
Se ha demostrado que la microvasculatura humana y células del sistema inmune humana se sustituyen en la propagación in vivo de tumores humanos 2,9. Factores tales como el subtipo de tumor, la tasa de crecimiento, y la región del trasplante tienen un gran impacto en el nivel global de la infiltración, así como la composición de los tipos de células de ratón encontrado. Sin embargo, incluso cuando estos factores se mantienen constantes, la cantidad y la composición de las células de ratón son muy variables.
Los análisis de aguas abajo de los tejidos xenoinjertados a menudo son desafiados por las células de origen murino. Los cultivos primarios de células tumorales humanas de xenoinjertos son frecuentemente cubiertas por los fibroblastos. Además dificulta la generación de líneas de células tumorales in vitro, ensayos de aguas abajo como las pruebas de citotoxicidad de drogas o farmacocinética están sesgados ya que en la corrección silico para los efectos procedentes de la contaminación de las células de ratón no es posible en la mayoría de los casos. Más allá de eso, la diafonía sólo se ha dilucidado en parte entre los fibroblastos de ratón y células tumorales humanas tiene un impacto directo en los resultados experimentales de estudios 10. Por otra parte, la variación más ampliamente impredecible de la infiltración de células de ratón agrava los análisis moleculares precisos aguas abajo. En NGS o proteoma analiza cada señal derivada de ratón medido en lugar de una señal de tumor humano disminuye directamente la sensibilidad de secuenciación. También los análisis de microarrays de expresión basados son desafiados por nuc murinoácidos transoleicos de hibridación posiblemente cruz para sondas humanos.
Con el fin de eludir los obstáculos de la contaminación de las células de ratón en los análisis posteriores de las células tumorales humanas a partir de modelos de xenoinjertos se han propuesto diferentes enfoques. En muchos estudios de células diana deseadas para el análisis de aguas abajo están aisladas mediante la utilización de marcadores o combinaciones de marcadores expresados exclusivamente en células tumorales humanas. Sin embargo, la falta de marcadores fiables para la identificación positiva de las células tumorales humanas con frecuencia representa un gran obstáculo. Incluso marcadores expresados en términos generales, como EpCAM en carcinomas humanos, con frecuencia muestran diferencias de expresión intrínseca del tumor 11. Esto aumenta el riesgo de que las subpoblaciones que expresan bajos, por ejemplo, células tumorales sufrido epitelial a mesenquimal transición, se pierden durante el aislamiento. Además, la unión directa de un agente de selección a la célula diana podría influir en los resultados de análisis subsiguientes. Los intentos de ozono células de ratónusando una combinación de anticuerpos específicos para CD45 murino y de clase epítopos del MHC I también se han hecho 12. Sin embargo, esta combinación de marcadores sólo detecta un subconjunto de células de ratón. Otro enfoque consiste en mejorar los procesos de análisis por software. Sin embargo, todos estos enfoques no son ya sea adecuado para cualquier tipo de configuración experimental o para cualquier entidad tumoral y el método de trasplante.
En este estudio se presenta un método novedoso y rápido para el ozono exhaustivamente las células de ratón a partir de tejidos xenoinjertados independientes de la cepa y tejido de origen de ratón. En exámenes en varios órganos diana y tejidos para trasplante de xenoinjertos (incluyendo la piel, pulmón, cerebro, riñón y músculo esquelético) hemos sido capaces de identificar una combinación de anticuerpos que permiten para la detección de células de ratón exhaustivamente. Estos anticuerpos se acoplaron a partículas superparamagnéticas, se titularon y optimizados para el agotamiento mediante el uso de clasificación de células magnético. Ya que sólo de ratón concretose utilizan los anticuerpos, las células diana humanas permanecen "sin tocar" y el método no se limita a tejido tumoral xenotransplantado. Demostramos que las células de ratón exhaustivamente la eliminación de las muestras tumorales xenoinjertados estandariza y facilita cultivos de células tumorales humanas. Además, se muestra que el análisis de xenoinjertos de tumores humanos por secuenciación de próxima generación se mejora significativamente. Como se observó este efecto a pesar de una selección específica de secuencia humana se ha llevado a cabo durante el enriquecimiento del exoma, se espera que la influencia sobre todo el genoma y la secuenciación del transcriptoma todo para ser aún más prominente. Tomados en conjunto, la eliminación de las células de ratón que utilizan este nuevo método facilita el cultivo de células tumorales humanas y mejora significativamente los análisis de aguas abajo de xenoinjertos de tumores humanos.
Hemos desarrollado un método rápido y fácil de aislar las células tumorales humanas vírgenes de tejido tumoral xenoinjertado. Este procedimiento se basa en el agotamiento completo de las células de origen de ratón mediante la combinación de la disociación de tejido automatizado y la clasificación de células magnético. Además de agotamiento de todas las células de ratón también la cantidad de células muertas y los desechos se reduce significativamente en la fracción de células diana. En conjunto, este método mejora significativamente análisis aguas abajo moleculares y cultivo de células tumorales humanas.
En contraste con los métodos alternativos, no hay necesidad de conocimiento de marcadores específicos de células tumorales, el ajuste a las diversas composiciones de células de ratón o establecimiento de algoritmos. El método presentado es independiente de la cepa de ratón y el tipo de tumor. Por lo tanto, un sesgo a través del aislamiento de subpoblaciones de tumores humanos sobre la base de marcadores específicos humanos individuales que pueden variar en la expresión, como se muestra para EpCAM 11, es evitared. Además, no está limitado a material de tumor pero se puede utilizar para cualquier tipo de tejido xenotransplantado como células de ratón están dirigidos en lugar de subpoblaciones específicas de tumores humanos (datos no mostrados).
la eliminación completa de las células de ratón se ve facilitada por la orientación epítopos de superficie expresados exclusivamente en células de origen murino. Aparte del método bien establecido para la disociación tumor tal como se presenta en este estudio, hay muchos procedimientos que utilizan diferentes tipos de enzimas. La preservación de epítopos de la superficie celular es un requisito previo para este nuevo método, sino también para análisis precisos de las poblaciones de células tumorales humanas. Por lo tanto, es crucial que las enzimas suaves se utilizan para la digestión del tejido tumoral. Por lo tanto, el agotamiento de células de ratón se puede utilizar solamente en combinación con procedimientos de digestión enzimáticos que, evidentemente, no afectan a epítopos específicos durante el procedimiento de reducción de células de ratón. En caso de duda, esto sólo puede ser verificada por el fabricante respectivo.
<pclass = "jove_content"> Este método también funciona para las células tumorales circulantes (CTC) humanos. Sin embargo, como las frecuencias de las células diana son generalmente <0,1% de eliminación de las células de ratón requiere, además, la lisis de glóbulos rojos y purezas de más de 50% no se puede esperar. En este caso, el agotamiento de células de ratón se puede utilizar como pre-enriquecimiento de CTC seguido de un enriquecimiento usando marcadores positivos (datos no presentados).La eliminación de las células de ratón mejora significativamente el cultivo de células tumorales humanas, evitando overgrow cultivo de fibroblastos de ratón. Además, el análisis de xenoinjertos de tumores humanos por secuenciación de próxima generación se ha mejorado y estandarizado de manera significativa. Como se observó este efecto a pesar de una selección específica de secuencia humana específica se ha llevado a cabo durante el enriquecimiento del exoma, se espera que la influencia sobre todo el genoma y la secuenciación del transcriptoma todo para ser aún más prominente.
Por otra parte, el método presentado facilita AccuraLos estudios moleculares del te de subpoblaciones tumorales en tumores humanos xwnotransplantado. La eliminación de las células de ratón a partir de una muestra respectiva en la primera etapa y, posteriormente, la clasificación células tumorales humanas en dos subpoblaciones diferentes permite la comparación molecular directo de la subpoblación tumor de interés a las células tumorales a granel humano 20. La expresión génica diferencial entre los subtipos de células tumorales se puede evaluar de forma más fiable, ya que no se ve afectada por la hibridación cruzada de moléculas derivadas de ratón.
The authors have nothing to disclose.
We are grateful to Janina Kuhl, Nadine Chelius, Petra Kussmann, Lena Willnow and Dorothee Lenhard for excellent technical assistance.
Tumor Dissociatio Kit, human | Miltenyi Biotec | 130-095-929 | contains enzymes H, R and A; see data sheet for reconstitution instructions |
RPMI 1640 | Biowest | L0501-500 | |
gentleMACS C-Tubes | Miltenyi Biotec | 130-096-334 | |
gentleMACS Octo Dissociator with Heaters | Miltenyi Biotec | 130-096-427 | |
MACS SmartStrainer (70 µm) | Miltenyi Biotec | 130-098-462 | |
Petri dish 100 mm | Various | ||
Scalpel | Various | ||
Mouse Cell Depletion Kit | Miltenyi Biotec | 130-104-694 | |
PBS | Various | use 1x PBS for PEB buffer | |
EDTA | Sigma-Aldrich | 3610 | use final concentration of 2 mM in PEB buffer |
BSA | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | or use 5 mg/L BSA in PEB buffer |
MACS LS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
PreSep filters (70 µm) | Miltenyi Biotec | 130-095-823 | |
MACSmix Tube Rotator | Miltenyi Biotec | 130-090-753 | |
CD326-FITC, human | Miltenyi Biotec | 130-080-301 | use 1:40 for immunofluorescence staining |
anti-Vimentin antibody | abcam | ab92547 | |
goat-anti-mouse IgG-Alexa488 | Life Technologies | A11029 | |
goat-anti-rabbit IgG-Alexa594 | Life Technologies | A11012 | |
DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | dilute to a final concentration of 0.1 µg/ml in 0.1 M sodium bicarbonate |
Inside Stain Kit | Miltenyi Biotec | 130-090-477 | InsideFix from this kit can be used for fixation step during immunofluorescence staining |
FBS | Various | ||
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 93418 | |
FcR Blocking Reagent, mouse | Miltenyi Biotec | 130-092-575 | |
Gelatin | Sigma-Aldrich | G2500-100g | |
Nextera Rapid Capture Enrichment Kit | Illumina | FC-140-1000 | |
MiSeq Reagent Kit v3 | Illumina | MS-102-3001 |