La mise en œuvre d'un système anti-Stokes cohérente Raman Scattering (CARS) sur un Ti: saphir et microscope à balayage laser OPO Based Laser Standard

Summary

Coherent diffusion anti-Stokes Raman (CARS) microscopie basée sur les vibrations inhérentes de liaisons moléculaires permet chimiquement sélective imagerie des cellules vivantes sans étiquette. Ce travail présente la mise en œuvre d'une technique de microscopie complémentaire sur un microscope à balayage laser multiphotonique standard basé sur un Ti femtoseconde: laser saphir et un laser OPO.

Abstract

microscopes à balayage laser combinant un Ti femtoseconde: laser saphir et un oscillateur paramétrique optique (OPO) pour dupliquer la ligne laser sont devenus disponibles pour les biologistes. Ces systèmes sont conçus principalement pour multivoie microscopie par fluorescence à deux photons. Cependant, sans aucune modification, la microscopie optique non linéaire complémentaire comme deuxième génération de l'harmonique (SHG) ou troisième génération harmonique (THG) peut également être effectuée avec ce set-up, ce qui permet l'imagerie sans étiquette de molécules structurées ou moyen aqueuse les interfaces lipidiques. Ces techniques sont bien adaptés à l' observation in vivo, mais sont limités dans la spécificité chimique. Chimiquement imagerie sélective peut être obtenue à partir de signaux de vibrations inhérentes basées sur la diffusion Raman. Confocale microscopie Raman offre une résolution spatiale en 3D, mais il nécessite une puissance moyenne élevée et de longue durée d'acquisition. Pour surmonter ces difficultés, les progrès récents dans la technologie laser ont permis l'develloppement de la microscopie non linéaire de vibration optique, en particulier anti-Stokes cohérente de diffusion Raman (CARS). Microscopie CARS a donc émergé comme un outil puissant pour l'imagerie cellulaire biologique et en direct, par les lipides de cartographie chimique (par vibration CH stretch), l'eau (via OH vibrations d'étirement), des protéines ou de l'ADN. Dans ce travail, nous décrivons la mise en œuvre de la technique CARS sur un balayage laser multiphotonique microscope OPO couplé standard. Elle est basée sur la synchronisation dans le temps des deux lignes laser en ajustant la longueur de l'un du trajet du faisceau laser. Nous présentons une mise en œuvre étape par étape de cette technique sur un système multiphotonique existant. Une formation de base en optique expérimentale est utile et le système présenté ne nécessite aucun équipement supplémentaire coûteux. Nous illustrons également CARS imagerie obtenus sur les gaines de myéline de nerf sciatique de rongeur, et nous montrons que cette imagerie peut être réalisée simultanément avec d'autres imagerie optique non linéaire, telle que la norme two-photon technique de fluorescence et de génération de seconde harmonique.

Introduction

La microscopie optique est devenue une technique importante pour la visualisation non destructive de processus dynamiques dans des systèmes biologiques vivants avec une résolution subcellulaire. La microscopie à fluorescence est actuellement le contraste d'imagerie le plus populaire utilisé dans les cellules vivantes en raison de sa haute spécificité et la sensibilité ^1. Une large palette de sondes fluorescentes a émergé (colorants exogènes, les protéines codées génétiquement, des nanoparticules de semi-conducteurs). Diverses techniques fluorescentes à base illumination de l' échantillon ont fleuri (telles que la microscopie confocale ou à deux pho....

Protocol

Figure 1. Vue schématique du général set-up Il comprend le Ti:. Saphir (680 - 1,080 nm) et l'OPO (1.050 - 1.300 nm) lasers, la ligne à retard avec les 4 miroirs (M ₁ à M _4), l'oscilloscope rapide, la photodiode et deux iris fixes diaphragmes I ₁ et I _2. Un miroir M ₂ et M ₃ sont fixés sur une platine de translation linéaire permettant de modifier la longueur de ligne de retard avec une résolution micrométrique. A 660 -. Bande nm filtre....

Results

La fréquence de la norme Ti de train d'impulsions: laser saphir est généralement autour de 80 MHz. Le BOA a la même fréquence, car il est pompé par le Ti: saphir laser. Un oscilloscope rapide d'au moins 200 MHz est donc nécessaire. Une photodiode rapide dans la gamme de 600 à 1100 nm est également nécessaire. Le décalage temporel maximal se produit lorsque le Ti: saphir et les signaux OPO sont décalés de 1 / (2 × 80 × 10 ⁶⁾ = 6.2 nanosecondes. Il correspond à un décalage maxim.......

Discussion

La partie la plus difficile du travail est la synchronisation temporelle des faisceaux laser. Elle exige une photodiode rapide combiné avec un oscilloscope rapide, mais seulement un chevauchement rugueux dans le temps peut être réalisée dans un premier temps. Ensuite, un ajustement supplémentaire de quelques cm est nécessaire. Enfin, micromètre se déplace d'une platine de translation linéaire permet d'effectuer le réglage fin final de la longueur de la ligne de retard afin de déclencher le signal CARS. Ce signal.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Oscilloscope	Tektronix	TDS 520D	500 MHz  ;
Photodétecteur	Thorlabs	DET08C/M, T4290	5 GHz InGaAs, 800 - 1 700 nm
Laser Ti :Sapphire Chameleon Ultra Family II	Oscillateur paramétrique optique cohérent
OPO Compact Family	APE Berlin
Axio Examiner microscope LSM 7 MP	Carl Zeiss
Périscope motorisé	Newport
Objectif W Plan-Apochromat 20X/1.0	Carl Zeiss
Combinateur de faisceaux	Carl Zeiss
Modulateur acousto-optique	Carl Zeiss
Atténuateur de puissance OPO	Carl Zeiss
Tube photomultiplicateur	Carl Zeiss
Logiciel ZEN	Carl Zeiss
filtres	Carl Zeiss	LSM BiG 1935-176	400 - 480 nm ; 500 - 550  ; Nm; 465 à 610 nm
Miroir dichroïque	Carl Zeiss Longueur d’onde		de coupure 760  ; nm
Rétroviseurs argentés	Newport	10D20ER.2  ;	&lambda ;/10, 480 - 20 000  ; nm, Quantité 4
Platine de translation monoaxe avec micromètre standard	Thorlabs	PT1/M	Quantité 1
Plaque d’expérimentation en aluminium	Thorlabs	MB1015/M  ;	Quantité 1
Monture de rétroviseur	Thorlabs	KMSS/M  ;	Quantité 4
Support de miroir pour & Oslash ; Optique 1"	Thorlabs	MH25	Quantité 4
Diaphragmes Iris  ;	Thorlabs	ID8/M	Quantité 3
Boîte de protection	Thorlabs	TB4, XE25L900/M, T205-1.0, RM1S	Quantité 1
Poteaux optiques	Thorlabs	TR40/M, PH50/M, PH75/M, BA2/M	Quantité 8 (longueurs selon la configuration)
661 - 690 nm Filtre passe-bande	Semrock	676/29 nm BrightLine® ; Filtre passe-bande monobande	Quantité 1
Perles fluorescentes	ThermoFisher	TetraSpeck&trade ; Microsphères fluorescentes Kit
taille Carte de visualisation laser	Thorlabs Carte de		visualisation laser IR
Verre de sécurité laser	Newport	LV-F22. P5L07  ;
FluoroMyéline&Commerce ; Coloration à la myéline fluorescente rouge  ;	ThermoFisher	F34652