Wet Chemistry and Peptide Immobilisation sur polytétrafluoroéthylène pour l'amélioration de l'adhérence cellulaire
Summary
Cell-adhesiveness is key to many approaches in biomaterial research and tissue engineering. A step-by-step technique is presented using wet-chemistry for the surface modification of the important polymer PTFE with peptides.
Abstract
Doter matériaux de surface avec des propriétés de cellules-adhésif est une stratégie commune dans la recherche biomatériau et l'ingénierie tissulaire. Ceci est particulièrement intéressant pour les polymères déjà approuvés qui ont une utilisation de longue date en médecine parce que ces matériaux sont bien caractérisées et les questions juridiques liées à l'introduction de polymères nouvellement synthétisés peuvent être évités. Polytétrafluoroéthylène (PTFE) est l'un des matériaux les plus fréquemment employés pour la fabrication de greffes vasculaires, mais le polymère manque d'adhérence cellulaire favorisant fonctions. Endothélialisation, soit une couverture complète de la greffe de surface interne avec une couche confluente de cellules endothéliales est considérée clé pour une performance optimale, notamment en réduisant la thrombogénicité de l'interface artificielle.
Cette étude porte sur la croissance des cellules endothéliales de PTFE peptidique modifié et compare ces résultats à ceux obtenus sur un substrat non modifié. Couplage avec leendothélial peptide adhésif de cellule Arg-Glu-Asp-Val (REDV) est réalisée via l'activation du polymère contenant fluorin utilisant le réactif naphtalénure de sodium, suivie par des étapes ultérieures de conjugaison. La culture cellulaire est réalisée en utilisant des cellules humaines endotheliales de veine ombilicale (HUVEC) et une excellente croissance cellulaire sur la matière peptidique immobilisé est démontrée sur une période de deux semaines.
Introduction
Divers polymères utilisés en médecine qui ont été approuvés pour un certain temps ne présentent pas la biocompatibilité améliorée, à savoir, le manque de cellules-adhésivité, l' induction de l' encapsulation fibrotique et thrombogénicité, pour ne citer que quelques – uns. Les interactions entre le biomatériau et le système biologique a lieu principalement à la surface de l'implant. En conséquence, les recherches ont porté sur la modification de surface afin de créer des propriétés appropriées pour une application désirée, tout en laissant les propriétés de la matière en vrac non affecté. Polytétrafluoroéthylène (PTFE) en tant que polymère physiologiquement inerte est utilisé dans de nombreux domaines médicaux tels que hernie treillis chirurgical 1, ports médicaux 2 et, surtout, des greffes vasculaires 3.
Notamment en cas de contact avec le sang de la nature hydrophobe de PTFE provoque une adsorption non spécifique des composants du plasma, et en conséquence l'adhérence des plaquettes, ce qui entraîne souvent thrombotic événements et de l' occlusion du greffon 4. En outre, le PTFE, comme la plupart des polymères, ne supporte pas l' adhésion cellulaire et la couverture qui serait une caractéristique souhaitable d'induire la formation d'une couche bénéfique des cellules endothéliales (EC) sur le (luminale) surface interne du greffon vasculaire 5. Un endothélium biomimétique devrait remplir plusieurs des fonctions de son équivalent naturel, notamment ses propriétés antithrombotiques 6. Une stratégie générale de modification biomimétique est basée sur le concept de doter le matériau exclusivement avec des cellules adhésivité tout en laissant les propriétés des matériaux en vrac non affecté. En outre, l' adhésion des plaquettes peut être réduite en incorporant l' anti-adhésif (anti-fouling) attribue 7. – Divers peptides principalement dérivés de protéines de la matrice extracellulaire – ont été décrits qui améliorent fortement l' adhésion cellulaire en se liant à des récepteurs cellulaires, appartenant à la classe des intégrines 8. L'êtrest exemple connu à cet égard est le peptide Arg-Gly-Asp (RGD) qui interagit avec la plupart des types de cellules. D'autres séquences d'acides aminés sont reconnus par les intégrines exclusivement exprimés sur des cellules spécifiques. Par exemple, Arg-Glu-Asp-Val (REDV) et Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg (YIGSR) ont été trouvés à se lier à CEs d'une manière spécifique 9. L' immobilisation covalente de ces peptides a été effectuée sur une grande variété de matériaux intrinsèquement non adhésives , y compris les métaux et les polymères 10,11.
PTFE poreux, plus précisément en PTFE expansé (ePTFE) – ainsi que le polyéthylène téréphtalate (PET) – est le matériau le plus important pour la production de greffes vasculaires 12. Techniques physiques établies pour les traitements appropriés, tels que la modification de plasma 13 ou par des méthodes photochimiques 14, sont entravés par le fait que les structures poreuses et / ou tubulaires ne sont pas faciles à traiter à l' intérieur des pores ou la lumière respectivement. La chimie humidele PTFE est une tâche difficile en raison de la nature hautement inerte du polymère contenant fluorin qui résiste à la plupart des attaques chimiques 15.
Dans cet article, nous décrivons une méthode relativement facile pour une stratégie de modification covalente. Adapté d'une procédure pour rendre le PTFE liable, les groupes fonctionnels ont été créés à la surface des matériaux qui servent de points d'ancrage pour la conjugaison en outre des molécules biologiquement actives.
Protocol
Representative Results
Discussion
La description détaillée du protocole de modification de la surface du PTFE se compose d'étapes successives en commençant par l'élimination du fluor à partir du squelette polymère tel que représenté sur la figure 6. Par conséquent, une couche est formée qui contient une quantité abondante de carbone-carbone conjuguées doubles liaisons conformément à la couleur brun foncé qui se sont développées lors du traitement naphtalénure. oxydation standard avec acide peroxyde d'hydro…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to acknowledge the help of Walter Scholdei (Max-Planck-Institute for Polymer Research, Mainz, Germany.
Materials
| PTFE foil 0.5 mm | Cadillac Plastic | n/a | |
| REDV peptide | Genecust | n/a | custom synthesis >95 % purity |
| iso-propanol | Sigma Aldrich | 34965 | |
| tetrahydrofurane (THF) | Sigma Aldrich | 401757 | |
| dimethylsulfoxide | Sigma Aldrich | D8418 | |
| molecular sieve 3Å | Sigma Aldrich | 208574 | |
| sodium metal | Sigma Aldrich | 483745 | |
| phosphate buffered saline (PBS) | Sigma Aldrich | D8537 | |
| naphthalene | Sigma Aldrich | 147141 | |
| hydrogen peroxide 30 % | Sigma Aldrich | 95321 | |
| trichloroacetic acid | Sigma Aldrich | T6399 | |
| diethylene glycol diglycidyl ether | Sigma Aldrich | 17741 | |
| hexamethylene diisocyanate (HMDI) | Sigma Aldrich | 52650 | |
| Calcein-AM | Sigma Aldrich | 56496 | |
| sodium bicarbonate | Sigma Aldrich | S6014 | |
| sodium azide | Sigma Aldrich | 71290 | |
| 24 well plates | Greiner-Bio-One | 662 160 | |
| ATR-FTIR spectrophotometer Nicolet Magna-IR 850 | Nicolet | n/a | |
| fluorescence microscope Olympus X-70 | Olympus | n/a | |
| humbilical vein endothelial cells (HUVECs) | Lonza | n/a | |
| ePTFE vascular graft | Gore | n/a |
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