Wet kjemi og Peptide Immobilisering på Polytetrafluoroethylene for Forbedret Cell-adhesjon
Summary
Cell-adhesiveness is key to many approaches in biomaterial research and tissue engineering. A step-by-step technique is presented using wet-chemistry for the surface modification of the important polymer PTFE with peptides.
Abstract
Endowing materialer overflaten med celle-lim egenskaper er en felles strategi i biomateriale forskning og tissue engineering. Dette er spesielt interessant for allerede godkjente polymerer som har en langvarig bruk i medisin fordi disse materialene er godt karakteriserte og juridiske problemstillinger knyttet til innføringen av nye syntetiserte polymerer kan unngås. Polytetrafluoretylen (PTFE) er en av de mest anvendte materialer for fremstilling av vaskulære transplantater, men at polymeren mangler celle-adhesjons-fremmende egenskaper. Endotelialisering, dvs. at fullstendig dekning av grafts indre overflate med et konfluent lag av endotelceller ansett nøkkelen til optimal ytelse, hovedsakelig ved å redusere trombogenisitet av den kunstige grensesnittet.
Denne studien undersøker veksten av endotelceller på peptid-modifisert PTFE og sammenligner disse resultatene med de som ble oppnådd med ikke-modifisert substrat. Kopling med denendotelcelle klebende peptidet Arg-Glu-Asp-Val (REDV) utføres via aktivering av fluorin-inneholdende polymer ved hjelp av reagenset natrium naphthalenide, etterfulgt av etterfølgende konjugasjon trinn. Cellekultur gjøres ved hjelp av menneskelig navleveneendotel Cells (HUVECs) og utmerket cellevekst på peptid-immobilisert materiale er vist over en to-ukers periode.
Introduction
Forskjellige polymerer som anvendes i medisin som er godkjent i noen tid ikke oppviser forbedret biokompatibilitet, dvs. manglende celle-klebrighet, induksjon av fibrotisk innkapsling og trombogenisitet, for å nevne noen få. Interaksjoner mellom biomaterialet og det biologiske system foregår hovedsakelig på overflaten av implantatet. Som en følge av dette har forskning fokusert på overflatemodifisering for å skape hensiktsmessige egenskaper for en ønsket anvendelse og samtidig la bulk materialets egenskaper upåvirket. Polytetrafluoretylen (PTFE) som en fysiologisk inert polymer er brukt i mange medisinske felt som brokk kirurgisk maske 1, medisinske porter 2 og, viktigst, vaskulære implantater 3.
Spesielt i blodet i kontakt situasjoner den hydrofobe karakter av PTFE bevirker uspesifikk adsorpsjon av plasmakomponentene, og som en konsekvens blodplateadhesjon, ofte resulterer i thrombotic hendelser og okklusjon av pode 4. Videre PTFE, som de fleste polymerer, støtter ikke cellulær adhesjon og dekning som ville være en ønskelig egenskap for å indusere dannelsen av et fordelaktig lag av endoteliale celler (ECS) på den indre (luminale) overflaten av det vaskulære implantat 5. En biomimetic endotelet er forventet å oppfylle mange av funksjonene til sin naturlige tilsvarende, særlig dens antithrombogenic egenskaper 6. En generell biomimetisk modifikasjon strategi er basert på konseptet med utelukkende endowing materialet med celle-klebrighet og samtidig la materialene bulkegenskapene upåvirket. I tillegg kan blodplateadhesjon reduseres ved inkorporering av anti-klebemiddel (anti-fouling) attributter 7. Forskjellige peptider – for det meste stammer fra proteiner fra den ekstracellulære matriks – er blitt beskrevet som sterkt forbedre celle-adhesjon ved å binde seg til cellulære reseptorer, som tilhører klassen av integriner 8. det værest kjent eksempel i denne forbindelse er peptidet Arg-Gly-Asp (RGD) som samvirker med de fleste celletyper. Andre aminosyresekvenser blir gjenkjent av integriner utelukkende uttrykt på spesifikke celler. For eksempel er Arg-Glu-Asp-Val (REDV) og Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg (YIGSR) blitt funnet å binde til ECS på en bestemt måte ni. Kovalent immobilisering av slike peptider er blitt utført på en mengde av iboende ikke-klebende materialer, inkludert metaller og polymerer 10,11.
Porøs PTFE, mer presist ekspandert PTFE (ePTFE) – sammen med polyetylentereftalat (PET) – er det viktigste material for fremstilling av vaskulære implantater 12. Etablerte fysiske teknikker for passende behandlinger, slik som plasma modifikasjon 13 eller ved fotokjemiske metoder 14, blir hemmet av det faktum at porøse og / eller rørformede strukturer er ikke lett lar seg behandle på innsiden henholdsvis porer eller lumen. Wet kjemipå PTFE er en vanskelig oppgave på grunn av den sterkt inerte natur av fluorin-inneholdende polymer som motstår de kjemiske angrep 15.
I denne beskrivelsen beskriver vi et forholdsvis lettvint fremgangsmåte for en kovalent modifikasjon strategi. Tilpasset fra en prosedyre for å gjengi PTFE bondable, ble funksjonelle grupper opprettet på materialer overflate som tjener som forankringspunkter for ytterligere konjugering av biologisk aktive molekyler.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den detaljerte beskrivelsen av overflatemodifisering protokoll av PTFE består av suksessive trinn som starter med eliminering av fluor fra polymerryggraden som vist i figur 6. Som et resultat av dette er et lag dannet som inneholder en rikelig mengde konjugerte karbon-karbon-dobbeltbindinger i samsvar med den mørke brunaktig farge som utvikles ved naphthalenide behandling. Standard oksidasjon med surt hydrogenperoksyd gir en hydroksylert overflate ledsaget av lysere til en lysebrun, gjenspeiler dette …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to acknowledge the help of Walter Scholdei (Max-Planck-Institute for Polymer Research, Mainz, Germany.
Materials
| PTFE foil 0.5 mm | Cadillac Plastic | n/a | |
| REDV peptide | Genecust | n/a | custom synthesis >95 % purity |
| iso-propanol | Sigma Aldrich | 34965 | |
| tetrahydrofurane (THF) | Sigma Aldrich | 401757 | |
| dimethylsulfoxide | Sigma Aldrich | D8418 | |
| molecular sieve 3Å | Sigma Aldrich | 208574 | |
| sodium metal | Sigma Aldrich | 483745 | |
| phosphate buffered saline (PBS) | Sigma Aldrich | D8537 | |
| naphthalene | Sigma Aldrich | 147141 | |
| hydrogen peroxide 30 % | Sigma Aldrich | 95321 | |
| trichloroacetic acid | Sigma Aldrich | T6399 | |
| diethylene glycol diglycidyl ether | Sigma Aldrich | 17741 | |
| hexamethylene diisocyanate (HMDI) | Sigma Aldrich | 52650 | |
| Calcein-AM | Sigma Aldrich | 56496 | |
| sodium bicarbonate | Sigma Aldrich | S6014 | |
| sodium azide | Sigma Aldrich | 71290 | |
| 24 well plates | Greiner-Bio-One | 662 160 | |
| ATR-FTIR spectrophotometer Nicolet Magna-IR 850 | Nicolet | n/a | |
| fluorescence microscope Olympus X-70 | Olympus | n/a | |
| humbilical vein endothelial cells (HUVECs) | Lonza | n/a | |
| ePTFE vascular graft | Gore | n/a |
References
- Doctor, H. G. Evaluation of various prosthetic materials and newer meshes for hernia repairs. J. Minim. Access Surg. 2, 110-116 (2006).
- Zaghal, A., et al. Update on totally implantable venous access devices. Surg. Oncol. 21, 207-215 (2012).
- Niu, G., Sapoznik, E., Soker, S. Bioengineered blood vessels. Exp. Opin. Biol. Th. 14, 403-410 (2014).
- Wang, M. -. J., Tsai, W. -. B. . Biomaterials in Blood-Contacting Devices: Complications and Solutions. , (2010).
- de Mel, A., Jell, G., Stevens, M. M., Seifalian, A. M. Biofunctionalization of biomaterials for accelerated in situ endothelialization: a review. Biomacromolecules. 9, 2969-2979 (2008).
- Zdrahala, R. J. Small caliber vascular grafts. Part I: state of the art. J. Biomat. Appl. 10, 309-329 (1996).
- Cleary, M. A., et al. Vascular tissue engineering: the next generation. Trends Mol. Med. 18, 394-404 (2012).
- Ruoslahti, E. RGD and other recognition sequences for integrins. Annu. Rev. Dev. Bi. 12, 697-715 (1996).
- Lei, Y., Remy, M., Labrugere, C., Durrieu, M. C. Peptide immobilization on polyethylene terephthalate surfaces to study specific endothelial cell adhesion, spreading and migration. J. Mat. Sci. Mater. M. 23, 2761-2772 (2012).
- Gabriel, M., et al. Covalent RGD Modification of the Inner Pore Surface of Polycaprolactone Scaffolds. J. Biomat. Sci.. Polym. E. 23, 941-953 (2012).
- Ceylan, H., Tekinay, A. B., Guler, M. O. Selective adhesion and growth of vascular endothelial cells on bioactive peptide nanofiber functionalized stainless steel surface. Biomaterials. 32, 8797-8805 (2011).
- Chlupac, J., Filova, E., Bacakova, L. Blood vessel replacement: 50 years of development and tissue engineering paradigms in vascular surgery. Physiol. Res. / Academia Scientiarum Bohemoslovaca. 58, 119-139 (2009).
- Wise, S. G., Waterhouse, A., Kondyurin, A., Bilek, M. M., Weiss, A. S. Plasma-based biofunctionalization of vascular implants. Nanomedicine UK. 7, 1907-1916 (2012).
- Mikulikova, R., et al. Cell microarrays on photochemically modified polytetrafluoroethylene. Biomaterials. 26, 5572-5580 (2005).
- Gabriel, M., Dahm, M., Vahl, C. F. Wet-chemical approach for the cell-adhesive modification of polytetrafluoroethylene. Biomed. Mater. 6, 035007 (2011).
- Gabriel, M., van Nieuw Amerongen, G. P., Van Hinsbergh, V. W., Amerongen, A. V., Zentner, A. Direct grafting of RGD-motif-containing peptide on the surface of polycaprolactone films. J. Biomat. Sci.. Polym. E. 17, 567-577 (2006).
- Larsen, C. C., Kligman, F., Kottke-Marchant, K., Marchant, R. E. The effect of RGD fluorosurfactant polymer modification of ePTFE on endothelial cell adhesion, growth, and function. Biomaterials. 27, 4846-4855 (2006).
- Gabriel, M., Nazmi, K., Veerman, E. C., Nieuw Amerongen, A. V., Zentner, A. Preparation of LL-37-grafted titanium surfaces with bactericidal activity. Bioconjugate Chem. 17, 548-550 (2006).
- Lotz, A., Heller, M., Brieger, J., Gabriel, M., Förch, R. Derivatization of Plasma Polymerized Thin Films and Attachment of Biomolecules to Influence HUVEC-Cell Adhesion. Plasma Process Polym. 9, 10-16 (2012).
