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Biologie du développement

再現性の高い小分子ベースの分化プロトコルを使用したヒト多能性幹細胞から心筋細胞の大規模生産

Published: July 25, 2016
doi:
10.3791/54276
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1Department of Stem Cells and Developmental Biology, Cell Science Research Center,Royan Institute for Stem Cell Biology and Technology, ACECR, 2Developmental and Stem Cell Biology Division,Victor Chang Cardiac Research Institute, 3St. Vincent´s Clinical School, Faculty of Medicine,University of New South Wales, 4School of Biotechnology and Biomolecular Sciences,University of New South Wales, 5Department of Developmental Biology,University of Science and Culture, 6Heart Centre for Children,The Children´s Hospital at Westmead, 7Sydney Medical School,University of Sydney, 8Department of Developmental Biology,University of Science and Culture, Tehran, Iran

Summary

Here, we present a robust, fast and scalable cardiomyocyte differentiation protocol for human pluripotent stem cells (hPSCs). Cardiomyocytes derived using this large-scale method can provide sufficient cell numbers for their effective use in human cardiovascular disease modeling, high-throughput drug screening, and potentially clinical applications.

Abstract

研究、疾患モデル、薬学的および臨床的適用のためのヒト多能性幹細胞（hPSCs）の利益を最大化することは、心筋細胞を含む機能的細胞型の大規模生産のためのロバストな方法が必要となります。ここでは、時間的なWNTの操作、TGF-β、及びSHHシグナル伝達経路は、単一セルの高効率心筋細胞への分化につながるが、静的なサスペンションと撹拌した懸濁液のバイオリアクターシステムの両方にHPSCラインを継代することを示しています。この戦略を採用することで、一貫複数HPSCラインで検証文化の15日後に> 80％の心筋トロポニンT陽性細胞を含む、〜100％破っスフェロイドをもたらしました。我々はまた、現在、単一細胞継代に適合していない細胞株で使用するために、このプロトコルの変化について報告する、の成功は42 HPSCラインに検証されています。これらのプロトコルを使用して生成された心筋細胞は、系統特異的なマーカーおよびshow期待electrophysを表現しますiological機能。我々のプロトコルは、ヒト心筋細胞の大規模生産のために、単純、効率的かつ堅牢なプラットフォームを提供します。

Introduction

ヒト胚性幹細胞（hESC）と人工多能性幹細胞（hiPSCs）を含む、ヒト多能性幹細胞（hPSCs）は、自己再生三胚葉1,2の細胞に分化する能力の能力を有します。これらの特性に、hPSCsは、6,7-高スループットドラッグスクリーニングおよび毒性アッセイのために、潜在的に臨床応用8のために、生成およびヒト疾患3-5をモデル化するための疾患関連細胞型のスケーラブルな生産のための貴重かつ無制限のソースを提供します。 hPSCsからの心筋細胞の生成は、具体的に起因する適切な動物モデルの欠如および/または影響を受けた一次組織の可用性に、以前に私たちの能力の範囲を超えて、複雑な人間の心血管疾患とその可能な治療のメカニズムを調査する機会を提供します。

hPSCs n個の前述のアプリケーションのすべて高度に濃縮および機能心筋細胞の膨大な数の生産をecessitate。このように、複数のHPSCラインに適した、インビトロ心臓分化プロトコルで 、効率的で再現性と拡張性の可用性が重要です。従来の心筋細胞分化プロトコルは、胚様体形成9共培養技術10、サイトカイン11およびタンパク質導入方法12のカクテルでの誘導のような異なる戦略を採用しています。これらの技術の進歩にもかかわらず、ほとんどまだ、効率が悪い苦しむ高価な成長因子を必要とする、または複数のHPSC回線を使用しようとすると、限られた普遍性を提供します。現在までに、これらの課題は、創薬13のための動物モデルにおいて、ならびに製薬業界で細胞治療研究のためHPSC由来の心筋細胞の生産に制限を設定しています。そのため、大型のための堅牢で手頃な価格の技術の開発スケーラブルな培養系における機能性HPSC由来の心筋細胞の-scale生産は、主にその商業的および臨床応用を促進するであろう。

本稿では、我々は非常に大規模生産のための方法を含め、ソースおよび培養の様々な方法から生成されたヒトES細胞とhiPSCsに高い有効性、再現性、適用性と費用対効果の高い、統合心臓分化システムの開発を報告しますバイオリアクターを使用してHPSC由来の心筋細胞の濃縮集団。さらに、当社は、そのような新たに設立されたhiPSCsまたは疾患のメカニズムの解析に関連するHPSCラインの大コホートとして、自由および/または単一細胞培養をフィーダするようになっていないHPSCラインにこのプロトコルを最適化しました。

Protocol

文化メディア、未分化hPSCsの細胞培養プレートのコーティングとメンテナンスの作製 メディアの準備 注：4週間まで光から保護して4℃で0.22μmの濾過装置とストアを使用してメディアを滅菌します。試薬名、仕入先とカタログ番号は、 材料表に記載されています。 マウス胚線維芽細胞（MEF）中には、445ミリリットルのDMEM、50ミリリット…

Representative Results

hPSCsからの心筋細胞の大規模な分化のための簡単な方法を確立するために、我々は16、その後WNTの阻害剤と細胞はWNT /βカテニン活性化因子（CHIR99021）で最初に処理されたプロトコルを作成/β-カテニンおよびトランスフォーミング増殖因子β（TGF-β）経路（IWP2 16およびSB431542 17、それぞれ）とソニックヘッジホッグ（SHH）経路（purmorphamine）の最…

Discussion

hPSCs由来の心筋細胞は、非常に魅力的なヒト疾患モデルで使用するためのソース、薬物スクリーニング/毒性試験と、おそらく将来的には、再生治療です。しかしながら、これらの細胞を使用する主なハードルの一つは、その効果的な使用のために十分に高品質の材料を提供する能力です。私たちの記載されているプロトコルを使用して、我々は、この限界を克服する方法を提供しています。…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This study was funded by grants provided from Royan Institute, Iranian Council of Stem Cell Research and Technology, the Iran National Science Foundation (INSF), the National Health and Medical Research Council of Australia (NHMRC; 354400), the National Heart Foundation of Australia/Heart Kids Australia (G11S5629), and the New South Wales Cardiovascular Research Network. HF was supported by a University International Postgraduate Scholarship from the University of New South Wales, Australia. RPH was supported by a NHMRC Australia Fellowship. The authors express their gratitude to the human subjects who participated in this research.

Materials

Knockout DMEM Life Technologies 10829018
Knockout Serum Replacement (KO-SR) Life Technologies 10828028
Glutamax Life Technologies 35050061
MEM Non-essential Amino Acids Life Technologies 11140-050
β-Mercaptoethanol Life Technologies 21985-023
Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) Miltenyi Biotec 130-093-843
RPMI1640 Life Technologies 11875093
DPBS, no calcium, no magnesium Life Technologies 14190144
DPBS Life Technologies 14287072
Attachment Factor (AF) Life Technologies S006100
ECM Gel Sigma-Aldrich E1270
Laminin Invitrogen 23017-015
DMEM Life Technologies 11965-092                                                                                                       
Fatal Bovine Serum (FBS) Life Technologies 16140-071
B27 minus insulin Gibco A18956-01
Penicillin/Streptomycin Life Technologies 15070063
0.05% Trypsin/EDTA Life Technologies 25300-054
Collagenase Type IV Life Technologies 17140-019
Calcium Chloride (CaCl2) Sigma-Aldrich C7902
Mitomycin C Bioaustralis BIA-M1183
CHIR99021 Miltenyi Biotec 130-104-172
IWP2 Miltenyi Biotec 130-105-335
SB431542 Miltenyi Biotec 130-095-561
Purmorphamine Miltenyi Biotec 130-104-465
ROCK inhibitor Y-27632 Miltenyi Biotec 130-104-169
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma-Aldrich E6758
Poly Vinyl Alcohol (PVA) Sigma-Aldrich 363073
Gelatin Sigma-Aldrich G1890
Trypan Blue Bio-Rad 145-0013
Accumax  Innovative Cell Technologies Inc. AM105
Sigmacote  Sigma-Aldrich SL2 
CELLSPIN Integra Biosciences 183 001
Spinner flask with 1 pendulum, 100 ml  Integra Biosciences 182 023
Mouse Embryonic Fibroblasts (MEF) Prepared in-house (or commercially available)
Human pluripotent stem cell (hPSC) lines Prepared in-house (or commercially available)
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References

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Citer Cet Article
Fonoudi, H., Ansari, H., Abbasalizadeh, S., Blue, G. M., Aghdami, N., Winlaw, D. S., Harvey, R. P., Bosman, A., Baharvand, H. Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol. J. Vis. Exp. (113), e54276, doi:10.3791/54276 (2016).
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