The assembly and positioning of the mitotic spindle depend on the combined forces generated by microtubule dynamics, motor proteins and cross-linkers. Here we present our recently developed methods in which the geometrical confinement of spherical emulsion droplets is used for the bottom-up reconstitution of basic mitotic spindles.
Mitotic spindle assembly, positioning and orientation depend on the combined forces generated by microtubule dynamics, microtubule motor proteins and cross-linkers. Growing microtubules can generate pushing forces, while depolymerizing microtubules can convert the energy from microtubule shrinkage into pulling forces, when attached, for example, to cortical dynein or chromosomes. In addition, motor proteins and diffusible cross-linkers within the spindle contribute to spindle architecture by connecting and sliding anti-parallel microtubules. In vivo, it has proven difficult to unravel the relative contribution of individual players to the overall balance of forces. Here we present the methods that we recently developed in our efforts to reconstitute basic mitotic spindles bottom-up in vitro. Using microfluidic techniques, centrosomes and tubulin are encapsulated in water-in-oil emulsion droplets, leading to the formation of geometrically confined (double) microtubule asters. By additionally introducing cortically anchored dynein, plus-end directed microtubule motors and diffusible cross-linkers, this system is used to reconstitute spindle-like structures. The methods presented here provide a starting point for reconstitution of more complete mitotic spindles, allowing for a detailed study of the contribution of each individual component, and for obtaining an integrated quantitative view of the force-balance within the mitotic spindle.
बँटवारा के दौरान दोहराया जीनोम के गुणसूत्रों सेल भूमध्य रेखा पर आयोजित कर रहे हैं नवगठित बेटी कोशिकाओं पर बहन क्रोमेटिडों का समान वितरण सुनिश्चित करने के लिए। क्रोमोजोम स्थिति और अलगाव दो विरोधी centrosomes से होने वाले धुरी सूक्ष्मनलिकाएं के लिए उनके लगाव द्वारा मध्यस्थता है। वफादार गुणसूत्र वितरण सुनिश्चित करने के लिए इसके अलावा, mitotic धुरी के उन्मुखीकरण भी कोशिका विभाजन विमान 1 लगती हैं। कोशिका विभाजन के समन्वित रुख विकास के कई चरणों के दौरान और ऊतक homeostasis 2 के लिए आवश्यक है। विशेष रूप से, विनियमित mitotic धुरा स्थिति सेलुलर सामग्री की विषम वितरण में परिणाम कर सकते हैं या यहां तक कि विभिन्न आकारों 2 की बेटी कोशिकाओं का उत्पादन। Mitotic धुरा विधानसभा और ओरिएंटेशन prophase में शुरू होता है और सहयोग और नाराज बल-जनरेटर 3,4 के बीच एक जटिल परस्पर क्रिया द्वारा करवाया जाता है। उत्पन्न बलों ख से मिलकर बनता हैअन्य संगठनों खींच और धक्का बलों। इन बलों दोनों सेल कोर्टेक्स के साथ धुरी संपर्कों से साथ ही धुरी के भीतर उत्पन्न, और microtubule गतिशीलता के साथ ही आणविक मोटर्स और पार linkers (चित्रा 1) द्वारा उत्पन्न किया जा सकता है।
धक्का बलों उत्पन्न किया जा सकता है जब इस तरह के सूक्ष्मनलिकाएं सेल कोर्टेक्स के रूप में कठोर संरचनाओं के खिलाफ बढ़ता है। प्रणाली के भीतर उत्पन्न कुल विरोध बल पर निर्भर करता है, इस mitotic धुरा (कम बलों) के repositioning में परिणाम या microtubule buckling या तबाही (उच्च बलों) 5-8 को गति प्रदान कर सकते हैं। बल की राशि है कि आगे बढ़ाने के द्वारा उत्पन्न किया जा सकता microtubule लंबाई पर निर्भर करता है, के बाद से लंबाई microtubule-buckling 9 के एक मजबूत निर्धारक है। इसके अलावा, सूक्ष्मनलिकाएं कि एक केंद्रपिंड से ही शुरू, एक तंत्र है कि जल्दी prophase 3,10 में केंद्रपिंड जुदाई ड्राइव करने के लिए सुझाव दिया गया है अन्य केंद्रपिंड के खिलाफ धक्का कर सकते हैं।
विज्ञापन मेंसेल कोर्टेक्स बढ़ रही सूक्ष्मनलिकाएं द्वारा उत्पन्न बलों धक्का, microtubule संपर्क छोर तक प्रत्यर्पण भी ताकतों 11 खींच मध्यस्थता कर सकते हैं। कई प्रयोगशालाओं से पता चला है कि cortical बल जनरेटर की नियंत्रित गतिविधि विवो 1 में mitotic स्पिंडल की विषम स्थिति के लिए आवश्यक है। इन खींच बलों के लिए आवश्यक कॉर्टेक्स-स्थानीय cytoplasmic dynein (इसके बाद 'के रूप में dynein' कहा जाता है), एक शून्य से अंत निर्देशित microtubule मोटर प्रोटीन 8,12,13 है। उदाहरण के लिए, खमीर, कोर्टेक्स 14 के साथ फिसलने मोटर निर्भर microtubule में microtubule जाली परिणाम के साथ cortical dynein के पार्श्व बातचीत नवोदित में। हालांकि, cortical खींच बलों को भी dynein की क्षमता सूक्ष्मनलिकाएं 8 depolymerizing करने के लिए अंत पर संलग्नक के रूप में करने के द्वारा उत्पन्न की जा सकती है। Microtubule संकोचन द्वारा उत्पन्न ऊर्जा बलों है कि आम तौर पर परिमाण अधिक की एक आदेश हैं करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं (~ 50 पी.एन. (संदर्भ के 15 </sअप>)) अलग-अलग मोटर प्रोटीन द्वारा उत्पन्न बलों की तुलना में (~ 7-8 पी.एन. (Ref। 16))। Depolymerizing सूक्ष्मनलिकाएं को cortical dynein के अंत पर कुर्की नवोदित खमीर 17 और सी में धुरी स्थिति को बढ़ावा देता है एलिगेंस 13। दोनों मोटर पर निर्भर फिसलने और microtubule depolymerization संचालित cortical खींच बलों सहयोग या विवो में परस्पर अनन्य हैं कर सकते हैं कि क्या वर्तमान अज्ञात पर है।
microtubule धक्का बलों और dynein की मध्यस्थता cortical खींच बलों के अलावा, केंद्रपिंड स्थिति कई अन्य प्रोटीन से mitotic धुरी के भीतर से नियंत्रित किया जाता है। Kinesin-5 मोटर्स, उदाहरण के लिए, tetramers कि पार से लिंक कर सकते हैं antiparallel interpolar सूक्ष्मनलिकाएं, जावक फिसलने बलों 18-20 की पीढ़ी में जिसके परिणामस्वरूप के रूप में मौजूद हैं। Kinesin-5 मोटर परिवार के सदस्य, केंद्रपिंड जुदाई और अध्ययन सभी eukaryotes में द्विध्रुवी धुरी विधानसभा के लिए आवश्यक हैं सी के अपवाद के साथ एलिगेंस (संदर्भ 21 में समीक्षा)।
इसके अलावा, Ase1 / PRC1 परिवार का प्रसारण पार linkers भी vivo में इन विट्रो 22-27 में interpolar सूक्ष्मनलिकाएं के microtubule क्षेत्रों ओवरलैपिंग को स्थानीय बनाना करने के लिए जाना जाता है। ओवरलैपिंग microtubule-क्षेत्र के Ase1 चालित विस्तार से उत्पन्न बलों काफी बड़े विट्रो 28,29 में kinesin -14 मध्यस्थता रपट बलों counterbalance करने के लिए कर रहे हैं। कोशिकाओं में, Ase1 / PRC1, धुरी midzone 25-27,30 में microtubule क्षेत्रों ओवरलैपिंग सुझाव है कि प्रसारण पार linkers द्वारा उत्पन्न बलों काफी धुरी संगठन में योगदान कर सकते स्थिर गठन के लिए आवश्यक है। अंत में, mitotic क्रोमेटिन से बलों और गुणसूत्रबिंदुओं विभिन्न रास्ते से 3 mitotic धुरा विधानसभा और स्थिति को प्रभावित करती है। चूंकि इन घटकों यहाँ वर्णित पुनर्गठन assays का हिस्सा नहीं हैं, वे विस्तार से चर्चा नहीं की जाएगी।
jove_content "> विभिन्न सिद्धांतों जीवित कोशिकाओं में प्रयोगों के लिए कैसे अलग आणविक घटकों और बलों ऊपर वर्णित धुरी विधानसभा और स्थिति में सहयोग पर मौजूद हैं, लेकिन हम अभी भी एक मात्रात्मक समझ से दूर हैं। इसके अलावा, शुद्ध घटकों के साथ इन विट्रो प्रयोगों एक शक्तिशाली प्रदान मार्ग में मदद करने के लिए इस लक्ष्य तक पहुँचने। यहाँ हम हाल ही में प्रकाशित तरीकों में से एक अनुकूलित और विस्तारित संस्करण (रोथ एट अल। 31), जिसमें बुनियादी स्पिंडल पानी में तेल पायस बूंदों में पुनर्गठन कर रहे हैं करने के लिए एक दृश्य गाइड मौजूद है, एक साथ शुरू घटकों की न्यूनतम संख्या के। microfluidic तकनीकों का प्रयोग, गोलाकार बूंदों आकार है कि mitotic कोशिकाओं के लिए तुलना कर रहे हैं के साथ उत्पन्न कर रहे हैं। इन बूँदों के भीतर, शुद्ध centrosomes और tubulin, microtubule एस्टर गतिशीलता का अध्ययन करने पीढ़ी और एस्टर-एस्टर बातचीत के लिए मजबूर क्रम में जोड़ा जा सकता है। By शुरू cortical (जैसे dynein के रूप में) और अंतर-ध्रुवीय (जैसे kinesin-5 / Ase1) बल-जनरेटर, हमतेजी से जटिल धुरी संरचनाओं की तरह है कि इन विवो स्थिति के समान करने के लिए शुरू पुनर्गठित।विधियों के पानी में तेल पायस बूंदों में बुनियादी mitotic स्पिंडल पुनर्गठित करने के लिए यहां उपस्थित हाल के प्रयासों का वर्णन किया। ज्यामितीय सीमाओं के भीतर धुरी विधानसभा के अध्ययन के अनेक लाभ प्रदान करता है। महत्वपूर्ण प्रतिक्रिया तंत्र mitotic धुरी के सूक्ष्मनलिकाएं और ज्यामितीय बाधाओं जिसमें वे इकट्ठा कर रहे हैं के बीच मौजूद हैं। सूक्ष्मनलिकाएं बलों को आगे बढ़ाने के लिए जब वे ज्यामितीय सीमाओं, जो mitotic धुरा विस्थापन में परिणाम कर सकते हैं के रूप में विकसित उत्पन्न कर सकते हैं। इसके अलावा, एक शारीरिक बाधा में बढ़ microtubule आपदाओं के लिए प्रेरित कर सकते हैं। इसके अलावा, एक सीमित ज्यामिति के भीतर धुरी विधानसभा में इस तरह के tubulin के रूप में अलग-अलग घटकों, जो बारी में सीधे microtubule विकास दर को प्रभावित करता है 36 के एक क्रमिक कमी करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं। ये धुरी विधानसभा की सभी आवश्यक निर्धारकों, जो assays यहाँ वर्णित का उपयोग कर अध्ययन किया जा सकता है।
वर्णित assays छोटे एकाग्रता विभिन्न करने के लिए बहुत संवेदनशील होते हैंछोटी बूंद घटकों के NCES। इस tubulin, जहां नाबालिग एकाग्रता मतभेद या तो बहुत धीमी गति से या बहुत तेजी से microtubule विकास में परिणाम कर सकते हैं के लिए मामला है। इस मामले में, microtubule विकास दर अक्सर अभी भी प्रयोग के पहले ~ 30 मिनट के दौरान तापमान समायोजन करके सुधारा जा सकता है। Mitotic धुरा विधानसभा और स्थिति भी (cortical) बल जनरेटर की एकाग्रता में बदलाव करने के लिए बहुत संवेदनशील है। यह एकाग्रता, पवित्रता और शुद्ध घटकों की गतिविधि पर निर्भर होने की संभावना है और हर हाल में शुद्ध प्रोटीन के लिए ध्यान से titrated किया जाना चाहिए।
इसके अलावा, कुछ व्यापार-नापसंद परख की प्रकृति पर निर्भर करता है इमेजिंग सेटिंग्स में किए जाने के लिए है। प्रारंभ में, घुलनशील फ्लोरोसेंट ट्यूबिलिन dimers के उच्च स्तर पर यह छवि व्यक्तिगत सूक्ष्मनलिकाएं करने के लिए कठिन बनाते हैं। सूक्ष्मनलिकाएं लंबी नहीं हो पाती और घुलनशील tubulin धीरे-धीरे समाप्त हो गया है के रूप में, संकेत करने वाली शोर अनुपात धीरे-धीरे उच्च हो जाता है और individu की इमेजिंग की अनुमति देता हैअल सूक्ष्मनलिकाएं। खुली प्रणाली के साथ setups के विपरीत, ज्यामितीय कारावास, एक थोक जलाशय के भीतर फ्लोरोसेंट अणु और ऑक्सीजन मेहतर प्रणाली घटकों के आदान-प्रदान को रोकता महत्वपूर्ण विरंजन में जिसके परिणामस्वरूप। विशेष रूप से समय के साथ धुरी विधानसभा और स्थिति की निगरानी के लिए, यह कम रोशनी की तीव्रता के साथ छवि के लिए आवश्यक है, यह भी एक शक्तिशाली ऑक्सीजन मेहतर प्रणाली की उपस्थिति में।
इन तरीकों में इन विट्रो में सरलीकृत धुरी की तरह संरचनाओं के नीचे अप पुनर्गठन सक्षम करें। घटकों यहां पेश करने के अलावा, कई अन्य कारकों द्विध्रुवी धुरी गठन, स्थिति, अभिविन्यास, आकार देने, आदि 3 प्रभावित करने के लिए वर्णित किया गया है। इस प्रणाली को आगे अतिरिक्त बल जनरेटर के व्यक्तिगत और संयुक्त प्रभाव का अध्ययन करने के लिए विस्तारित किया जा सकता है। कि वर्तमान में इस प्रणाली से अनुपस्थित रहे हैं धुरी गठन के लिए महत्वपूर्ण योगदान mitotic गुणसूत्रों हैं। Mitotic क्रोमेटिन दिखाया गया है(1) chromokinesins प्रत्यक्ष धुरी गठन उत्पन्न कर सकते हैं तथाकथित 'ध्रुवीय-इजेक्शन ताकतों' 3, (2) क्रोमेटिन बाध्य RanGEF RCC1 38 से एक RanGTP ढाल के गठन, (3) गुणसूत्रबिंदुओं कि (depolymerizing के साथ बातचीत कर सकते हैं ) सूक्ष्मनलिकाएं 39 और (4) क्रोमेटिन ही है, जो विरोध कर सूक्ष्मनलिकाएं 40 के बीच में एक यांत्रिक वसंत के रूप में कार्य कर सकते हैं।
अंत में, वर्णित प्रणाली वर्तमान गतिविधि पर सीमित अस्थायी और स्थानिक नियंत्रण और शुरू बल-जनरेटर का स्थानीयकरण प्रदान करता है। कोशिकाओं में, कई धुरी विधानसभा कारकों विशिष्ट डिब्बों को स्थानीय बनाना या एक प्रतिबंधित समय खिड़की के भीतर सक्रिय हैं। एक हड़ताली उदाहरण dynein की गतिविधि है, जो विशेष रूप से सी के पीछे की ओर से समृद्ध है एलिगेंस एक सेल चरण भ्रूण विषम धुरी स्थिति और कोशिका विभाजन को बढ़ावा देने के लिए। इस प्रणाली में, हम वर्तमान में ऐसी टी नकल उतार की संभावना तलाश रहे हैंemporal और विषम गतिविधि का उपयोग तरीकों ऑप्टो आनुवंशिक तकनीक से उधार लिया। इसके अलावा, के रूप में सी के लिए मामला है एलिगेंस भ्रूण और एक कठोर सेल की दीवार के साथ कोशिकाओं, कई कोशिकाओं बँटवारा में ऊपर दौर नहीं है। ज्यामितीय कारावास की आकृति बलों धुरी 41 पर अभिनय पर एक मौलिक प्रभाव पड़ेगा। इसलिए यह धुरी विधानसभा और गैर गोलाकार बूंदों में स्थिति को पुनर्गठित करने के साथ ही, संभवतः अधिक जटिल microfluidic प्रणाली है कि आकार देने की अनुमति है और पायस के भंडारण बूंदों 42,43 का उपयोग कर महत्वपूर्ण होगा। अंत में, ऊतकों में, सेल सेल और सेल सब्सट्रेट संकेतन और लगाव बाहरी संकेत है कि निर्देशित धुरी उन्मुखीकरण में अनुवाद किया जा सकता है, प्रदान के रूप में अक्सर उपकला कोशिकाओं में मनाया जाता है और स्टेम कोशिकाओं। इन विशिष्ट पहलुओं के सभी खाते में इस मौजूदा अध्ययन में नहीं लिया गया है और mitotic धुरा assemb से अधिक में विवो तरह reconstitutions की दिशा में बनाने के लिए भविष्य की चुनौतियों प्रदान हो सकता हैLy और स्थिति।
The authors have nothing to disclose.
We like to thank the members of the Dogterom lab for valuable discussions. We acknowledge Stefan Diez and Marcel Janson for reagents, and Samara Reck-Peterson for help with the purification of dynein. This work was supported by funding from the European Research Council (ERC Synergy grant: MODEL-CELL).
1. Preparation of microfluidic chips | |||
Photomask (Photomask on film substrate) | Selba S.A. Switzerland | ||
SU-8 3025 | MicroChem | ||
Silicon wafer (4 inch silicon wafer p/Boron <1-0-0> 10-20 Ω-cm, 500-550μm, SSP, w/2 flats) | WRS Materials | 4P0SSP-005 | |
Spin coater | Polos | SPIN150I | |
PDMS pre-polymer RVT615 A+B | Lubribond | 9481 | |
Corona treater | Electro-technic products | BD-20ACV | |
2. Microfluidic setup | |||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
DOPS (1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine) | Avanti Polar Lipids | 840035 | |
Biotinyl PE (1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(biotinyl)) | Avanti Polar Lipids | 870285 | |
Chloroform | Sigma-Aldrich | 650498 | |
Glass pipets | |||
Glass tubes | |||
Vacuum pump | Laboport | KNF | |
Vacuum chamber | Kartell | Polypropylene Vacuum Desiccator | |
Mineral oil | Sigma-Aldrich | M5904 | |
Surfactant (Span80) | Sigma-Aldrich | 85548 | |
Sonicator | Branson | M2800H | |
Coverslips | 24x60mm, thickness 1.5 | ||
Glass-slides | 26x76mm | ||
Puncher | Harris Uni-Core | 135840/135841/135843 | |
Laboratory sealing film | Parafilm | ||
Valap (Vaseline, lanolin, paraffin wax melted at equal concentrations) | Home made | ||
Brightfield Microscope | Leica | PMIRB | Any inverted brightfield would suffice |
Pressure controler | Fluigent | MFCS-FLEX-4C-1000 | |
PEEK Tubing | Cluzeau Info. Labo, France | ||
Microfluidics vials (Tubes Micrew 0.5 ml and 1 ml) | VWR, The Netherlands | ||
3. Reconstituting spindle formation and positioning | |||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Dextran-647nm (Dextran, Alexa Fluor 647, 10,000 MW, Anionic, Fixable) | Life Technologies | ||
Tween-20 | Sigma-Aldrich | ||
BSA – Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | ||
Glucose (D-(+)-Glucose) | Sigma-Aldrich | G8270 | |
Glucose-oxidase (Glucose oxidase from Aspergillus niger) | Sigma-Aldrich | G6125 | |
DTT (DL-dithioltheitol) | Sigma-Aldrich | 646563 | |
Catalase (Catalase form bovine liver) | Sigma-Aldrich | C9322 | |
Tubulin (Tubulin from bovine brain) | Cytoskeleton Inc. | ||
Tubulin-488/561 (HiLyte-488/Rhodamine-labeled tubulin from porcine brain) | Cytoskeleton Inc. | ||
GTP (Guanosine-'5-triphosphate, sodium salt hydrate) | Sigma-Aldrich | 51120 | |
κ-casein (κ-casein from bovine serum milk) | Sigma-Aldrich | C0406 | |
Airfuge (Air-driven ultracentrifuge) | Beckman-Coulter | CLS | |
4. Introducing spindle-assembly factors | |||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Neutravidin | Sigma-Aldrich | A2666 | |
ATP (Adenosine-'5-triphosphate, disodium salt hydrate) | Sigma-Aldrich | A9187 | |
PEP (Phospho(enol)pyruvic acid monosodium salt hydrate ≥ 97% (enzymatic)) | Sigma-Aldrich | P0564 | |
PK/LDH -(Pyruvate kinase/lactic dehydrogenase enzymes from rabbit muscle) | Sigma-Aldrich | P0294 |