Nanoformulated分子の送達を研究するためのモデル：ラット血液脳関門を通過して、FITCロードフェリチンのin vitro浸透で
Summary
A method to establish an in vitro model of blood-brain barrier based on a co-culture of rat brain microvascular endothelial cells and astrocytes is described and validated. This system proved to be a valid tool to study the effect of nanoformulation on the trans-barrier permeation of fluorescent molecules.
Abstract
Brain microvascular endothelial cells, supported by pericytes and astrocytes endfeet, are responsible for the low permeation of large hydrosoluble drugs through the blood-brain barrier (BBB), causing difficulties for effective pharmacological therapies. In recent years, different strategies for promoting brain targeting have aimed to improve drug delivery and activity at this site, including innovative nanosystems for drug delivery across the BBB. In this context, an in vitro approach based on a simplified cellular model of the BBB provides a useful tool to investigate the effect of nanoformulations on the trans-BBB permeation of molecules. This study describes the development of a double-layer BBB, consisting of co-cultured commercially available primary rat brain microvascular endothelial cells and astrocytes. A multiparametric approach for the validation of the model, based on the measurement of the transendothelial electrical resistance and the apparent permeability of a high molecular weight dextran, is also described. As proof of concept for the employment of this BBB model to study the effect of different nanoformulations on the translocation of fluorescent molecules across the barrier, we describe the use of fluorescein isothiocyanate (FITC), loaded into ferritin nanoparticles. The ability of ferritins to improve the trans-BBB permeation of FITC was demonstrated by flux measurements and confocal microscopy analyses. The results suggest this is a useful system for validating nanosystems for delivery of drugs across the BBB.
Introduction
薬理学的治療に対する中枢神経系（CNS）の疾患（ すなわち 、癌、てんかん、うつ病、統合失調症およびHIV関連神経障害）の抵抗は、血液脳関門（BBB）を横切る困難な薬物透過を含む様々な異なるメカニズムによるものです。 BBBは、血液中を循環する物質から脳組織を分離する境界です。この障壁の中で、周皮細胞およびアストロサイトエンドフィートでサポートされている脳微小血管内皮細胞（BMECs）の層が、ダ1 400よりも高い分子量を有するものを水溶性の薬剤に対するBBBの高い選択性に責任があります。他の薬物関連耐性機構は、CNSへの薬物の浸透を減少させ、脳2から自分の押し出しを容易にするために、協働薬物排出トランスポーター（P-糖タンパク質及び多剤耐性タンパク質）のBMECsの存在にリンクされています。
過去十年間で、ナノテクノロジーの手法の多くは、BBB 3-6にわたって薬物を送達するの臨床的および生物学的な課題に応えるために開発されてきました。この文脈では、フェリチンナノスフィア（FNN）は、完全に革新的かつ有望なソリューションを表しています。 FNNは8nmで内径の中空球状構造で配置されている24の自己集合フェリチン（FN）モノマーの12 nmの球体です。フェリチンサブユニットは、酸性pHで分解し、種々の有機分子をカプセル化することができるように、中性のpHをもたらすことにより、形状記憶様式で再構築することができます。したがって、FNNは、多機能性薬物送達システム7,8の開発のための興味深いモデルを表します。また、FNNは、これらの細胞9の管腔側膜上に発現されるトランスフェリン受容体（TfRと）1、の特異的認識にBMECsのおかげと相互作用することができます。
これまで、BBBのin vitroモデルで異なるがオード開発されていますrは、様々な薬物、BBBに向かって毒性、または排出トランスポーターとの分子の相互作用にトランスBBBの透過性を解明します。確かに、これらのモデルは、 インビトロで有効であると考えているin vivo試験に進む前に、活性分子の迅速なスクリーニングのために近づきます。これらのモデルは、動物（ラット、マウス、ブタおよびウシ）またはヒト細胞株10,11,12から得られたBMECsまたは共培養BMECsとアストロサイト（まれ周皮細胞）の単一内皮層、から構成されています。経内皮電気抵抗（TEER）と定義された分子量を有するトレーサーの見かけの透過性（P アプリ ）は、in vitroモデルの品質を決定するために使用される2つの重要なパラメータを表します。ここでは、フルオレセインisothiを内包フェリチンナノケージのトランスBBB透過を研究するためにラットBMECs（RBMECs）およびラット皮質アストロサイト（RCAS）の共培養に基づいて、BBB のin vitroモデルの雇用を記述するocyanate（FITC）。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここに記載のin vitroの方法は、ナノ粒子とナノ製剤の際に蛍光分子のトランスBBBの配信を研究するための有用な検証アプローチを表します。ここでは、BBBを通過カーゴ分子の転座を研究するための良好な候補を表しFNNを、使用しています。それは、特にBMECsの管腔膜上に発現し、受容体媒介インターナリゼーション経路を使用してナノ粒子の取り込みを媒介するTfR1受容体によって認識?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors acknowledge Assessorato alla Sanità, Regione Lombardia and Sacco Hospital (NanoMeDia Project) for research funding.
Materials
| Rat Brain Microvascular Endothelial Cells | Innoprot | P10308 | isolated from Sprague Dawley rat brain tissue, cryopreserved at passage one and delivered frozen |
| Cortical Astrocytes | Innoprot | P10202 | isolated from 2 days rat brain tissue, cryopreserved at passage one and delivered frozen. |
| Endothelial Cell Medium kit | Innoprot | P60104 | ECM (500 ml) and fetal bovin serum (25 ml), endothelial cell growth supplement (5 ml) and penicillin/streptomycin (5 ml). Warm in 37 °C water bath before use and protect from light |
| Trypsin-EDTA without Phenol Red | EuroClone | ECM0920D | Warm in 37 °C water bath before use |
| Fluorescein isothiocyanate-dextran 40000 | Sigma | FD40S | protect from light |
| paraformaldehyde | Sigma | 158127 | diluition in chemical hood |
| Dulbecco's phosphate buffer saline w/o Ca and Mg | EuroClone | ECB4004L | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| bovine serum albumin | Sigma | A7906 | |
| goat serum | EuroClone | ECS0200D | |
| mouse monoclonal anti-Von Willebrand Factor | Dako | M0616 | |
| AlexaFluor 546-conjugated antibody against mouse IgGs | ThermoFischer Scientific | A-11003 | protect from light |
| DAPI (4’ ,6-diamidino-2-phenylindole) | ThermoFischer Scientific | D1306 | protect from light |
| ProLong Gold Antifade Mountant | ThermoFischer Scientific | P36934 | |
| Poly-L-lysine Hydrobromide | Sigma | P1274 | the same solution can be used several times |
| fibronectin from bovine plasma | Sigma | F1141 | the same solution can be used several times |
| Polyethylene terephthalate (PET) inserts | Falcon | F3090 | Transparent Polyethylene terephthalate (PET) membranes; surface area: 4.2 cm2; pore size 0.4 µm/surface area |
| T75 Primo TC flask | EuroClone | ET7076 | |
| T175 Primo TC flask | EuroClone | ET7181 | |
| EVOM2 Epithelial Tissue Volt/Ohmmeter | World Precision Instruments Germany | EVOM2 | |
| Endohm- 24SNAP cup | World Precision Instruments Germany | ENDOHM-24SNAP | |
| Light/fluorescence microscope with camera | Leica Microsystems | DM IL LED Fluo/ ICC50 W Camera Module | inverted microscope for live cells with camera |
| Confocal Microscope | Leica Microsystems | TCS SPE |
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