कॉर्नियल उपकला घाव भरने के दौरान गर्मी झटका प्रोटीन 27 के समारोह के शाही सेना के हस्तक्षेप के आधार पर जांच
Summary
Herein, we present a protocol to use heat shock protein 27 (HSP27)-specific small interfering RNA to assess the function of HSP27 during corneal epithelial wound healing. RNA interference is the best method for effectively knocking-down gene expression to investigate protein function in various cell types.
Abstract
Small interfering RNA (siRNA) is among the most widely used RNA interference methods for the short-term silencing of protein-coding genes. siRNA is a synthetic RNA duplex created to specifically target a mRNA transcript to induce its degradation and it has been used to identify novel pathways in various cellular processes. Few reports exist regarding the role of phosphorylated heat shock protein 27 (HSP27) in corneal epithelial wound healing. Herein, cultured human corneal epithelial cells were divided into a scrambled control-siRNA transfected group and a HSP27-specific siRNA-transfected group. Scratch-induced directional wounding assays, and western blotting, and flow cytometry were then performed. We conclude that HSP27 has roles in corneal epithelial wound healing that may involve epithelial cell apoptosis and migration. Here, step-by-step descriptions of sample preparation and the study protocol are provided.
Introduction
कॉर्नियल उपकला कोशिकाओं (सीईसी) लगातार आंसू फिल्म में बहा रहे हैं, जबकि वे एक साथ किनारी और corneal उपकला बेसल परतों से कोशिकाओं द्वारा प्रतिस्थापित कर रहे हैं। 1 विभिन्न बाह्य तनाव apoptosis और सीईसी की विशल्कन पैदा कर सकते हैं। 2 गर्मी झटका प्रोटीन (HSPs) अत्यधिक संरक्षित कर रहे हैं और आणविक आकार के अनुसार दो परिवारों में बांटा जा सकता है। 3 सबसे बड़ा HSP परिवार HSP90, HSP70, और HSP60, और छोटे परिवार HSP27 भी शामिल है। 4 HSP27 के फोस्फोराइलेशन सेल अस्तित्व में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाने के लिए जाना जाता है और actin remodeling में इस प्रोटीन की भूमिका की वजह से सेल प्रवास के लिए आवश्यक है। 5-7 इसलिए, हम उपकला घाव भरने की इन विट्रो मॉडल में मुख्य चुनाव आयुक्त प्रवास और apoptosis में HSP27 फोस्फोराइलेशन की संभावित भूमिका का परीक्षण करने का प्रयास किया।
शाही सेना हस्तक्षेप (आरएनएआई) या तो छोटे या कम दखल RNAs का उपयोग कर (siRNA) जीई हैदोनों बुनियादी और अनुप्रयुक्त जीव विज्ञान में nerated ब्याज, के रूप में यह संभवतः अनुमति देता हित के किसी भी जीन की अभिव्यक्ति खटखटाया नीचे जा सकता है। 8 के साथ साथ, हम सीईसी घाव भरने और apoptosis के लिए HSP27 के योगदान का आकलन करने के HSP27-विशिष्ट siRNA इस्तेमाल किया। कोशिकाओं में जीन तोड़े नीचे के लिए पारंपरिक तरीकों आरएनएआई दो असंशोधित 21-मेर ओलईगोन्युक्लियोटाईड्स कि siRNAs बनाने के लिए इकट्ठा किया जा सकता सहित सिंथेटिक आरएनए duplexes, का उपयोग करें। आरएनएआई siRNA है कि हम इस वर्तमान अध्ययन में इस्तेमाल कोशिकाओं transfect करने के लिए एक सरल और अत्यधिक कारगर तरीका है, और इस अभिकर्मक विभिन्न अमर सेल लाइनों के साथ काम करता है। इस वर्तमान अध्ययन में, हम एक खरोंच प्रेरित दिशात्मक घाव परख, पश्चिमी सोख्ता, siRNA अभिकर्मक परख, immunofluorescence परख सहित इस विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया तरीकों, प्रदर्शन, और प्रवाह cytometry।
Protocol
Representative Results
Discussion
In this present study, we evaluated the potential role of HSP27 in corneal epithelial wounding using in vitro approaches. The critical steps involved siRNA transfection for HSP27 knock-down to observe the function of HSP27 in cells subjected to stress. Notably, a role for HSP27 was revealed by these experiments in epithelial cell migration and apoptosis during corneal epithelial wound healing. Unlike previous studies10 that used rat HSP27-specific siRNA to transfect vascular smooth muscle cells, we us…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस अध्ययन में चिकित्सा, सोल, कोरिया के उल्सान कॉलेज विश्वविद्यालय के छात्र रिसर्च ग्रांट (13-14) और लाइफ साइंसेज के लिए आसन संस्थान, सोल, कोरिया से अनुदान (2014-464) द्वारा समर्थित किया गया।
Materials
| Biological safety cabinet | CHC LAB Co.Ltd, Daejeon, Republic of Korea | CHC-777A2-06 | Class II, Type A2 |
| Stealth RNAi™ siRNA | Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA | RNAi siRNA; scrambled control-siRNA and HSP27-specific siRNA | |
| BEGMTM | Lonza, Inc., Walkersville, MD | CC-3171, CC4175 | Bronchial epithelium growth medium |
| Protease inhibitor | Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO | P8340 ,P7626 | 1 uM Pepstatin A, 1 uM Leupetin, 0.1 uM Aprotin |
| Bradford protein assay | Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA | #500-0001 | Bradford protein assay |
| Nitrocellulose filters | Amersham, Little Chalfont, UK | RPN3032D | Western blotting membrane |
| Non-phosphorylated HSP27 | Abcam Inc., Cambridge, MA | ab12351 | 1:1000 dilution (Total HSP27) |
| Phosphorylated HSP27 (Ser85) | Abcam Inc., Cambridge, MA | ab5594 | 1: 1000 dilution HSP27 was phosphorylated at Ser85 |
| Lipofectamine® RNAiMAX reagent | Invitrogen, Carlsbad, CA | 13-778-075 | Transfection reagent |
| Phosphorylated Akt (Ser473) | Cell Signaling Technology, Danvers, MA | No. 4060 | 1: 1000 dilution Akt was phosphorylated at Ser473 (cell survival marker) |
| Non-phosphorylated Akt | Cell Signaling Technology, Danvers, MA | No. 4061 | 1:1000 dilution (Total Akt) |
| Bcl-2-associated X protein | Cell Signaling Technology, Danvers, MA | No. 4062 | 1: 1000 (anti-apoptotic protein marker) |
| GAPDH | Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA | No. 4063 | 1:1000 loading control marker (house keeping gene) |
| Horseradish peroxidase-conjugated goat anti-rabbit antibodies | Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA | NCI1460KR | 1:10000 dilution |
| OPTI-MEM | Invitrogen, Carlsbad, CA | 31985 | reduced serum medium for transfection |
| Image analysis software | Olympus, Inc., Tokyo, Japan | Image-Pro Plus 5.0 | |
| Skimed milk powder | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlstruhe, Germany | T145.2 | |
| Tris | Amresco LCC, Inc. Solon, OH | No-0497 | |
| Sodium Chloride | Amresco LCC, Inc. Solon, OH | No-0241 | |
| Six well culture plate | Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA | 140675 | 35.00 mm diameter / well |
| 24-well culuture dish | Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA | 142475 | |
| Orbital shaker | N-Bioteck, Inc., Seoul, South Korea | NB1015 | |
| Bovine serum albumin | Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA | sc-2323 | |
| BDFACSCantoTM II | BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ | Flow cytometry | |
| X-Ray Film | Kodak, Rochester, NY | Medical X-Ray Cassette with Green 400 Screen | |
| western blotting luminol reagent | Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA | sc-2048 | |
| FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I | BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ | 556547 |
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