A high-throughput assay for enzyme screening is described. This multiplexed ready-to-use assay kit comprises of pre-chosen Chromogenic Polymer Hydrogel (CPH) substrates and complex Insoluble Chromogenic Biomass (ICB) substrates. Target enzymes are polysaccharide degrading endo-enzymes and proteases.
Carbohydrates active enzymes (CAZymes) have multiple roles in vivo and are widely used for industrial processing in the biofuel, textile, detergent, paper and food industries. A deeper understanding of CAZymes is important from both fundamental biology and industrial standpoints. Vast numbers of CAZymes exist in nature (especially in microorganisms) and hundreds of thousands have been cataloged and described in the carbohydrate active enzyme database (CAZy). However, the rate of discovery of putative enzymes has outstripped our ability to biochemically characterize their activities. One reason for this is that advances in genome and transcriptome sequencing, together with associated bioinformatics tools allow for rapid identification of candidate CAZymes, but technology for determining an enzyme’s biochemical characteristics has advanced more slowly. To address this technology gap, a novel high-throughput assay kit based on insoluble chromogenic substrates is described here. Two distinct substrate types were produced: Chromogenic Polymer Hydrogel (CPH) substrates (made from purified polysaccharides and proteins) and Insoluble Chromogenic Biomass (ICB) substrates (made from complex biomass materials). Both CPH and ICB substrates are provided in a 96-well high-throughput assay system. The CPH substrates can be made in four different colors, enabling them to be mixed together and thus increasing assay throughput. The protocol describes a 96-well plate assay and illustrates how this assay can be used for screening the activities of enzymes, enzyme cocktails, and broths.
Techniques for mining genomes and metagenomes have developed rapidly in recent years, and so have medium- and high-throughput strategies for cloning and expressing recombinant enzymes. Furthermore, bioinformatic resources and associated depositories, such as (CAZy)1,2 have expanded greatly. However, there are considerable challenges inherent in the exploitation of microbial enzyme diversity for industrial purposes and the empirical determination of enzyme activities has now become a serious bottleneck. For example, it is estimated that, using current methods, we can safely predict the activities of no more than 4% of the proteins within the CAZy database. Although numerous methods are available for monitoring enzyme activities they all have some limitations. Well-established techniques based on chromatography combined with mass spectrometry are available for assessing the oligomeric fragments of glycosyl hydrolase (GH) activities3,4. However, these approaches are labor intensive and generally low-throughput. Methods based on the measurement of reducing sugars such as the dinitrosalicylic acid5 and Nelson-Somogyi6 assays are widely used for assessing GH activities. However, these assays have limited throughput and can be prone to side-reactions. Individual chromogenic polysaccharide substrates, such as azurine cross-linked (AZCL) are widely used for determination of enzyme activities, but purchasing all of the substrates separately and manually distributing the substrate powders within the assay plate can be cumbersome and costly7.
We have developed a new generation of chromogenic polymer hydrogel (CPH) substrates based on chlorotriazine dyes that, when used in conjunction with a 96-well filter plate, form a high-throughput assay system. Additional Insoluble Chromogenic Biomass (ICB) substrates were developed which provide information about substrate availability within complex polymer mixtures, such as those that exist in lignocellulosic biomass. Each substrate can be produced in one of four colors, and different colored substrates can be combined in a single well. In this protocol is shown that this methodology can be applied to a wide variety of polysaccharides and proteins and the potential for screening GHs, lytic polysaccharide monooxygenases (LPMOs) and proteases. Specific protocols are provided for the use of 96 well plates and representative results illustrate the high efficiency of the CPH and ICB substrate kits as tools for enzyme screening.
One significant advantage of the assay kits described, regardless of the substrate, is that the kits are ready to use within 15 minutes, after the activation step. This eliminates the need for time-consuming assembly of the assay from raw substrate materials as it is the case with some other methods7. The CPH and ICB substrates have excellent storage (at least one year at room temperature), pH and temperature stability 8 and require no specialized equipment or training. The CPH or ICB assays are based on 96-well filter plate within which the reaction with the enzyme is conducted. If the enzyme is active with a given substrate, soluble dyed oligomers are generated, producing a colored supernatant which can then be filtered into a regular clear-well 96-well plate using a vacuum manifold or a centrifuge 8.
The substrates are dyed with chlorotriazine dyes which absorb in the visible spectrum (VIS) range and individual colors (red, blue, yellow and green) can be resolved using linear regression if different CPH substrates of different colors are mixed in a single well, and the enzyme acts on more than one substrate. The resulting plate with the supernatants can be measured using a standard microtiter-plate reader capable of measuring absorbance in the VIS range. Mixing different substrates with different colors in one well increases the throughput of the assay system, to a total of 384 experiments in a 96-well plate (4 different substrates of different colors per well).
CPH substrates provide a valuable tool for assessing the specific activity of an enzyme while ICB substrates are used to evaluate the capacity of an enzyme to digest a component within the context of complex substrate mixtures that enzymes usually encounter within biomass. Although ICB substrates do not provide information about individual enzyme specificities, they are nonetheless useful tools for assessing the commercial performance of enzymes, cocktails or broths.
Vi bruker en ny generasjon av flerfargede CPH og ICB underlag som er basert på klortriazin fargestoffer (full liste av underlag i tabell 1) arrangert i en spesialdesignet kommersiell analyse kit. Enzymoppløsning av substratene gir små, løselige, farget produkter som er påvisbare i analyseoppløsning og kan kvantifiseres ved anvendelse av en plateleser 9. Denne analysen er utformet for evaluering av endo -acting enzymer og sensitiviteten til analysen er lik den ved hjelp av en azurine tverrbundet (AZCL) substrater 10, mens andre fremgangsmåter er tilgjengelige for exo -acting enzymer 11,12. Begrensningen av denne analysen kit ligger i deteksjon av endo -enzyme aktivitet, CPH samt ICB underlag ikke er nedbrytbare ved exo -enzymes mest sannsynlig på grunn av sterisk hindring som følge av fargestoff og tverrbindingsmolekyler 8.
Analysen utføres i en 96-AGl format og individuelle reaksjoner finner sted i brønnene. Reaksjonen må blandes i platen for å få reproduserbare data. De resulterende supernatantene filtreres inn i et produkt plate hvor absorbansen til hver brønn kan kvantifiseres ved hjelp av absorbans-spektrometri. De grunnleggende prinsipper og utformingen av analysen er vist i figur 1. Analysen består av en analyseplate (en 96-brønns filterplate) med substratene, og etter inkubasjon med enzymer, blir supernatanten filtreres gjennom inn i en klar brønners plate og absorbansene leses å gi en semi-kvantitativ måling av enzym spesifisitet og aktivitet. Det har vist seg, at denne screening-analyse ved bruk av CPH substrater kan også brukes i en agarplate format, hvor de oppløselige reaksjonsprodukter lage en farget halogen etter inkubasjon over natten. 8
Analysesett kan brukes til å screene rensede enzymer og deres potensielle side aktivitet som demonstrert iFigur 2. Side-aktiviteter kan oppstå fra et enkelt enzym og dets promiskuøse spesifisitet, men også fra et faktum at prøven analyseres er en blanding av forskjellige enzymer og deres synergistisk effekt må studeres. I tillegg, som det har vært vist i tidligere studier, at enzym cocktails, tarmbakterieflora 13 og dyrkningsvæsker fra sopp 8 så vel som endogen plante-enzym og bakterier (upubliserte data) kan anvendes som en enzymkilde.
ICB underlag løse komplekse blandinger av celleveggkomponenter ofte oppstått i industrielle prosesser for nedbryting av biomasse. Disse underlag er utformet for å evaluere polysakkarid tilgjengelighet og gi informasjon om hvordan du effektivt optimalisere nedbrytnings cocktails for mer effektiv nedbrytning utgang. Som illustrert i figur 3 CPH og ICB underlag kan brukes i enzym screening ved siden av hverandre – å avsløre et vell av informasjon om enzymet spesifisitet end aktivitet både i sammenheng med den foretrukne substrat (CPH) og en mer naturlig kompleks som inneholder andre komponenter i tillegg til det foretrukne substratet nærmere å etterligne en makromolekylær sammenstilling som finnes i naturen (ICB). Bruk av flere farger muliggjør samtidig deteksjon av forskjellige enzymaktiviteter mot flere substrater som øker hurtig og multiplexity av analysen. Spektra for forskjellige fargestoffer kan løses ved enkel lineær regresjon, og i de fleste tilfeller flere substrat-aktivitet kan observeres ved visuell inspeksjon alene. En simulert eksempel på et slikt eksperiment, og resultatene er vist i figur 4.
Denne analysen verktøykasse og allsidigheten til sin søknad er svært godt egnet for første nivå screening av enzymer og kulturbuljonger med ukjente aktiviteter. De viktigste aspektene ved denne analysen er det høy gjennomstrømming natur, skreddersy, brukervennlighet og fleksibilitet. Med det i tankene, we tror at denne romanen sett med verktøy vil gi betraktelig bedre og raskere enzym screening prosesser i industriell samt akademiske programmer.
The authors have nothing to disclose.
Vi ønsker å takke professor J. Paul Knox (University of Leeds, UK), som ga tilgang til hans laboratorier for filming, og Susan E. Marcus for utmerket teknisk assistanse. JS erkjenner WallTraC prosjektet (European Commission syvende rammeprogram (tilskuddsavtalen. Nr: 263 916) og prosjektet biomasse for det 21. århundre (Innovasjon fundament Danmark, sak nr .: 103408) SKK takker den SET4Future prosjektet (Dansk Strategic Research Council), Bio-Value Strategisk grunnlagt av den danske Rådet for Strategic Research, den danske Rådet for teknologi og innovasjon (Grant sak nr .: 0603-00522B), og en biologi-drevet tilnærming for å forstå enzymatisk nedbrytning av Complex polysakkarid Systems (Grant Saksnr .:. 107 279) for finansiering Dette papiret reflekterer forfatternes syn bare den europeiske union er ikke ansvarlig for bruk som kan gjøres av informasjonen inneholde her..
assay kit plates | Glycospot | customized assay kit plates | |
activation solution | Glycospot | for activating CPH substrates | |
350 ml receiver plate spacer block for vacuum manifold | Pall Corporation | 5015 | spacer block |
96-well MultiScreen HV filter plate, 0.45 µm, clear, non-sterile | Millipore | MSHVN4510 | assay plate |
96-Well Microplates, Polypropylene | Greiner Bio-One | 651201 | collection plate after washing the substrates |
Nunc™ MicroWell™ 96-Well Microplates | Thermo Scientific | 269620 | product plate |
Diaphragm pump MZ 2 NT | Vacuubrand | 732000 | vacuum pump used with the vacuum manifold |
Infors HT Ecotron | Infors HT | 4950132 (Buch & Holm) | horizontal shaker |
SpectraMax M5 | Molecular Devices | 10067-750 (VWR) | 96-well plate absorbance reader |
Vacuum manifold | Pall Corporation | 5017 | vacuum manifold |
endo-cellulase (EGII) (Trichoderma longibrachiatum) | Megazyme | E-CELTR | cellulase [cel] |
endo-β-1,4-mannanase (Cellvibrio japonicus) | Megazyme | E-BMACJ | mannanase [man] |
endo-β-1,3-glucanase (Trichoderma spp.) | Megazyme | E-LAMSE | β-glucanase [glu] |
endo-b-1,4-D-galactanase (Aspergillus niger) | Megazyme | E-EGALN | galactanase [gal] |
endo-β-1,4-xylanase M4 (Aspergillus niger) | Megazyme | E-XYAN4 | xylanase [xyl] |
endo-xyloglucanase (GH5) (Paenibacillus sp.) | Megazyme | E-XEGP | xyloglucanase [xg] |
α-amylase (Bacillus licheniformis) | Megazyme | E-BLAAM | amylase [amy] |