Patch Clamp optagelser på Intact dorsalrodsganglier fra voksne rotter
Summary
This manuscript describes how to prepare intact dorsal root ganglia for patch clamp recordings. This preparation maintains the microenvironment for neurons and satellite glial cells, thus avoiding the phenotypic and functional changes seen using dissociated DRG neurons.
Abstract
Patch clamp undersøgelser fra dorsalrodsganglier (DRG) neuroner har øget vores forståelse af det perifere nervesystem. I øjeblikket er de fleste optagelser foretaget på dissocierede DRG-neuroner, hvilket er en standard forberedelse til de fleste laboratorier. Neuronale egenskaber, men kan ændres ved axonal skade som følge af enzym fordøjelse bruges i at erhverve dissocierede neuroner. Endvidere kan dissocierede neuron præparater, der ikke fuldt ud repræsentere mikromiljø af DRG da tab af kontakt med satellit gliaceller, der omgiver de primære sensoriske neuroner er en uundgåelig konsekvens af denne metode. For at overvinde de begrænsninger i at bruge konventionelle dissocierede DRG-neuroner til patch clamp optagelser, i denne rapport beskriver vi en metode til at forberede intakte DRG og gennemføre patch clamp optagelser på individuelle primære sensoriske neuroner ex vivo. Denne fremgangsmåde tillader hurtig og enkel tilberedning af intakte DRG, efterligner ivivo betingelser ved at holde DRG-neuroner forbundet med deres omgivende satellit gliaceller og basalmembranen. Endvidere fremgangsmåden undgår axonal skade mod manipulation og enzym fordøjelse såsom når dissociering DRG. Denne ex vivo præparat kan yderligere anvendes til at studere interaktionen mellem primære sensoriske neuroner og satellit gliaceller.
Introduction
Sensation er afgørende for en organismes overlevelse og trivsel. Transmissionen af stimuli er afhængig af de sensoriske veje, der starter ved perifere endelser axoner fra primære sensoriske neuroner. Primære sensoriske neuroner, med undtagelse af mesencephale kerne af trigeminusnerven, er placeret i den trigeminale ganglier og dorsalrodsganglier (DRG). De tjener som dørvogtere af den sensoriske information 1. På perikarial membran, ligesom på centrale og perifere terminaler, DRG-neuroner udtrykker receptorer og ionkanaler, såsom glutamatreceptorer, TNF alfa-receptorer, forbigående receptor potentielle kation kanal underfamilie V medlem 1 (TRPV1), natriumkanaler mv 2 -7. Patch clamp optagelser af perikarial membran tillader forstå funktionelle ændringer af mange af disse receptorer og kanaler i hele neuron.
Patch-clamp optagelse teknik er et stærkt værktøj til STUdøende aktiviteter kanaler eller receptorer og en lang række undersøgelser er blevet udført ved at anvende denne teknik på DRG-neuroner 8-10. I de fleste undersøgelser DRG fjernes ved at skære den dorsale rodspirerne og spinal nerve tæt på ganglion. Efter hakning, er ganglion derefter placeret i fordøjelsesenzymer, der resulterer i dissociation af DRG-neuroner, som derefter kan registreres straks eller dyrket i flere dage forud for optagelse. Desværre dissociation af DRG-neuroner involverer en nødvendig axotomi tæt på perikarya. Når dissocieret og axotomiserede, DRG-neuroner undergår fænotypiske ændringer samt ændringer i membran ophidselse 11,12. Tabet af kontakt mellem perikarya af individuelle neuroner og satellit gliaceller, der normalt omgiver dem kan bidrage til disse ændringer 13. Den krydstale mellem neuroner og satellit gliaceller er både afgørende fysiologiske forhold og i tilpasning til pathologiCal betingelser som dem, der fører til intraktabel smerte 14,15. Det ville være en udfordring at studere interaktionen mellem neuroner og satellit gliaceller bruger dissocieret DRG præparat.
Intakte DRG, på den anden side giver tættere på in vivo betingelser. I de sidste mange år, har vores laboratorium, samt nogle andre grupper, brugt intakte DRG fra voksne rotter til at undersøge ændringer af primære sensoriske neuroner i forskellige forhold, der er forbundet med kroniske smerter 3-5,11,15-17. Selvom de teknikker, der anvendes i disse undersøgelser noget er etableret, en trin-for-trin beskrivelse er endnu ikke blevet offentliggjort. I den foreliggende manuskript, beskriver vi en bekvem og hurtig måde at fremstille intakte DRG og deres anvendelse til patch clamp optagelser.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi rapporterer en metode til at forberede hele DRG til patch clamp studier. Der er flere vigtige elementer for at forberede en ideel eksemplar. For det første er det vigtigt at dissekere DRG med dorsale rødder fastgjort. Efter dette, epineurium skal fjernes omhyggeligt og samtidig undgå beskadigelse af neuroner. Endelig, for at blotlægge de neuroner og de omgivende satellit gliaceller, er det nødvendigt at fordøje det resterende bindevæv. Intakte DRG fra voksne rotter tilberedt med den her beskrevne metode vil op…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to acknowledge the Painless Research Foundation for support of the work. This work was also supported by the NIH grants R01 NS080921-01 and R21 NS079897-01A1.
Materials
| Pentobarbital sodium | vortech Pharmaceuticals | ||
| syringe | BD | 309659 | 1 ml, 5 ml. |
| scalpel | BD | size: 15 | |
| Mayo straight scissor | Fine Science Tools | 14010-15 | |
| Mayo curved scissor | Fine Science Tools | 14011-15 | |
| Rongeur | Fine Science Tools | 16021-14 | |
| Adson toothed forceps | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Iris Scissor | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Noyes spring scissor | Fine Science Tools | 15124-12 | |
| Bone scissors | Fine Science Tools | 16044-10 | Special for cutting the bones. |
| Forceps: Dumont, Dumoxel Biologie #5 | Fine Science Tools | 11252-30 | These have the fine tips that do not need sharpening when first purchased. |
| periosteal elevator | Sklar | 97-0530 | |
| Dissection microscope | WILD | ||
| Transfer pipette | Fisher brand | 13-711-5AM | |
| Petri dish (10 cm) | Pyrex | Glass petri dish can avoid damaging the tips of fine forceps | |
| Collagenase (Liberase TM) | Roche | 05-401-119-001 | dissolve at the concentration of 13 u/ml, aliquot into glass pipette. Avoid repeated freeze and thaw. |
| filter | Thermo scientific | 7232520 | Filter the internal solutions for patch clamp recording to avoid clog. |
| Glass pipette | Sutter | BF150-110-7.5 | |
| Anchor | Havard apparatus | 64-0250 | stabilize the DRG to avoid drift. |
| Peristaltic pump | WPI | ||
| Pipette puller | Sutter | P97 | |
| Amplifier | Molecular devices | Axopatch 200B | |
| Digitizer | Molecular devices | 1440D | |
| Microscope | NIKON | FN600 | |
| Micro-manipulator | Sutter | MPC200 | |
| microinjection dispense system | General Valve | Picrospitzer II | fast drug application system |
| Carbogen (95% O2, 5% CO2) | Local Medical Gas supplier |
References
- Basbaum, A. I., Bautista, D. M., Scherrer, G., Julius, D. Cellular and molecular mechanisms of pain. Cell. 139, 267-284 (2009).
- Caterina, M. J., et al. The capsaicin receptor: a heat-activated ion channel in the pain pathway. Nature. 389, 816-824 (1997).
- Gong, K., Bhargava, A., Jasmin, L. GluN2B N-methyl-D-aspartate receptor and excitatory amino acid transporter 3 are upregulated in primary sensory neurons after 7 days of morphine administration in rats: implication for opiate-induced hyperalgesia. Pain. 157, 147-158 (2016).
- Gong, K., Kung, L. H., Magni, G., Bhargava, A., Jasmin, L. Increased response to glutamate in small diameter dorsal root ganglion neurons after sciatic nerve injury. PloS one. 9, 95491 (2014).
- Gong, K., Zou, X., Fuchs, P. N., Lin, Q. Minocycline inhibits neurogenic inflammation by blocking the effects of tumor necrosis factor-alpha. Clin Exp Pharmacol Physiol. , (2015).
- Ohtori, S., Takahashi, K., Moriya, H., Myers, R. R. TNF-alpha and TNF-alpha receptor type 1 upregulation in glia and neurons after peripheral nerve injury: studies in murine DRG and spinal cord. Spine. 29, 1082-1088 (2004).
- Waxman, S. G., Cummins, T. R., Dib-Hajj, S., Fjell, J., Black, J. A. Sodium channels, excitability of primary sensory neurons, and the molecular basis of pain. Muscle nerve. 22, 1177-1187 (1999).
- Zhang, J. M., Song, X. J., LaMotte, R. H. Enhanced excitability of sensory neurons in rats with cutaneous hyperalgesia produced by chronic compression of the dorsal root ganglion. J Neurophysiol. 82, 3359-3366 (1999).
- Dib-Hajj, S. D., et al. Plasticity of sodium channel expression in DRG neurons in the chronic constriction injury model of neuropathic pain. Pain. 83, 591-600 (1999).
- Cummins, T. R., et al. A novel persistent tetrodotoxin-resistant sodium current in SNS-null and wild-type small primary sensory neurons. J Neurosci. 19, RC43 (1999).
- Zheng, J. H., Walters, E. T., Song, X. J. Dissociation of dorsal root ganglion neurons induces hyperexcitability that is maintained by increased responsiveness to cAMP and cGMP. J Neurophysiol. 97, 15-25 (2007).
- Schoenen, J., Delree, P., Leprince, P., Moonen, G. Neurotransmitter phenotype plasticity in cultured dissociated adult rat dorsal root ganglia: an immunocytochemical study. J Neurosci Res. 22, 473-487 (1989).
- Hanani, M. Satellite glial cells: more than just ‘rings around the neuron’. Neuron Glia Biol. 6, 1-2 (2010).
- Takeda, M., Nasu, M., Kanazawa, T., Shimazu, Y. Activation of GABA(B) receptors potentiates inward rectifying potassium currents in satellite glial cells from rat trigeminal ganglia: in vivo patch-clamp analysis. Neurosciences. 288, 51-58 (2015).
- Zhang, H., et al. Altered functional properties of satellite glial cells in compressed spinal ganglia. Glia. 57, 1588-1599 (2009).
- Fan, N., Donnelly, D. F., LaMotte, R. H. Chronic compression of mouse dorsal root ganglion alters voltage-gated sodium and potassium currents in medium-sized dorsal root ganglion neurons. J Neurophysiol. 106, 3067-3072 (2011).
- Fan, N., Sikand, P., Donnelly, D. F., Ma, C., Lamotte, R. H. Increased Na+ and K+ currents in small mouse dorsal root ganglion neurons after ganglion compression. J Neurophysiol. 106, 211-218 (2011).
- Sherman-Gold, R. . The Axon Guide. , (2008).
- Cummins, T. R., Rush, A. M., Estacion, M., Dib-Hajj, S. D., Waxman, S. G. Voltage-clamp and current-clamp recordings from mammalian DRG neurons. Nat Protoc. 4, 1103-1112 (2009).
- Zhang, J. M., Donnelly, D. F., LaMotte, R. H. Patch clamp recording from the intact dorsal root ganglion. J Neurosci Methods. 79, 97-103 (1998).
- Benn, S. C., Costigan, M., Tate, S., Fitzgerald, M., Woolf, C. J. Developmental expression of the TTX-resistant voltage-gated sodium channels Nav1.8 (SNS) and Nav1.9 (SNS2) in primary sensory neurons. J Neurosci. 21, 6077-6085 (2001).
- Funakoshi, K., et al. Differential development of TRPV1-expressing sensory nerves in peripheral organs. Cell Tissue Res. 323, 27-41 (2006).
- Hayar, A., Gu, C., Al-Chaer, E. D. An improved method for patch clamp recording and calcium imaging of neurons in the intact dorsal root ganglion in rats. J Neurosci Methods. 173, 74-82 (2008).
- Yagi, J., Sumino, R. Inhibition of a hyperpolarization-activated current by clonidine in rat dorsal root ganglion neurons. J Neurophysiol. 80, 1094-1104 (1998).
- Ma, C., Donnelly, D. F., LaMotte, R. H. In vivo visualization and functional characterization of primary somatic neurons. J Neurosci Methods. 191, 60-65 (2010).
- Vit, J. P., Jasmin, L., Bhargava, A., Ohara, P. T. Satellite glial cells in the trigeminal ganglion as a determinant of orofacial neuropathic pain. Neuron Glia Biol. 2, 247-257 (2006).
