वयस्क चूहों से बरकरार पृष्ठीय रूट ganglia पर पैच दबाना रिकॉर्डिंग
Summary
This manuscript describes how to prepare intact dorsal root ganglia for patch clamp recordings. This preparation maintains the microenvironment for neurons and satellite glial cells, thus avoiding the phenotypic and functional changes seen using dissociated DRG neurons.
Abstract
पृष्ठीय रूट ganglia से पैच दबाना स्टडीज (DRGs) न्यूरॉन्स परिधीय तंत्रिका तंत्र के बारे में हमारी समझ को बढ़ा दिया है। वर्तमान में, रिकॉर्डिंग के बहुमत अलग डीआरजी न्यूरॉन्स, जो सबसे अधिक प्रयोगशालाओं के लिए एक मानक तैयारी है पर आयोजित की जाती हैं। Neuronal गुण, तथापि, axonal चोट एंजाइम अलग न्यूरॉन्स प्राप्त करने में इस्तेमाल किया पाचन से उत्पन्न द्वारा बदला जा सकता है। इसके अलावा, अलग न्यूरॉन की तैयारी पूरी तरह से डीआरजी का microenvironment का प्रतिनिधित्व नहीं कर सकते हैं क्योंकि उपग्रह glial कोशिकाओं है कि प्राथमिक संवेदी न्यूरॉन्स के चारों ओर के साथ संपर्क के नुकसान के लिए इस विधि का एक अपरिहार्य परिणाम है। पैच दबाना रिकॉर्डिंग के लिए पारंपरिक अलग डीआरजी न्यूरॉन्स का उपयोग करते हुए, इस रिपोर्ट में सीमाओं को पार करने के लिए हम बरकरार DRGs तैयार है और अलग-अलग प्राथमिक संवेदी न्यूरॉन्स पूर्व vivo पर पैच दबाना रिकॉर्डिंग संचालन करने के लिए एक विधि का वर्णन। यह दृष्टिकोण, अक्षत DRGs के तेजी से और सीधा तैयारी परमिट में नकल उतारडीआरजी अपने आसपास उपग्रह glial कोशिकाओं और तहखाने झिल्ली के साथ जुड़े न्यूरॉन्स रखकर शर्तों विवो। इसके अलावा, विधि हेरफेर से axonal चोट से बचा जाता है और इस तरह जब DRGs अलग कर के रूप में पाचन एंजाइम। इस पूर्व vivo तैयारी अतिरिक्त प्राथमिक संवेदी न्यूरॉन्स और उपग्रह glial कोशिकाओं के बीच बातचीत का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
Introduction
सनसनीखेज एक जीव के अस्तित्व और भलाई के लिए आवश्यक है। उत्तेजनाओं के संचरण प्राथमिक संवेदी न्यूरॉन्स से axons की परिधीय अंत में शुरू संवेदी रास्ते पर निर्भर है। प्राथमिक संवेदी न्यूरॉन्स, trigeminal तंत्रिका के mesencephalic नाभिक के अपवाद के साथ, त्रिपृष्ठी ganglia और पृष्ठीय रूट ganglia (DRGs) में स्थित हैं। वे संवेदी जानकारी 1 के द्वारपाल के रूप में सेवा करते हैं। Perikarial झिल्ली में सिर्फ मध्य और परिधीय टर्मिनलों पर के रूप में, डीआरजी न्यूरॉन्स ऐसे ग्लूटामेट रिसेप्टर्स, टीएनएफ अल्फा रिसेप्टर्स, क्षणिक रिसेप्टर संभावित केशन चैनल उपप्रजाति वी सदस्य 1 (TRPV1), सोडियम चैनल, आदि के रूप में 2 रिसेप्टर्स और आयन चैनल, एक्सप्रेस -7। perikarial झिल्ली के पैच दबाना रिकॉर्डिंग इन रिसेप्टर्स और चैनलों न्यूरॉन भर के कई के कार्यात्मक परिवर्तन को समझने के लिए अनुमति देते हैं।
पैच दबाना रिकॉर्डिंग तकनीक अध्ययन के लिए एक शक्तिशाली उपकरण हैचैनल या रिसेप्टर्स और अध्ययन की एक बड़ी संख्या की गतिविधियों मर डीआरजी न्यूरॉन्स 8-10 पर इस तकनीक को लागू करने से आयोजित किया गया है। ज्यादातर अध्ययनों में डीआरजी पृष्ठीय rootlets और नाड़ीग्रन्थि करने के लिए रीढ़ की हड्डी में तंत्रिका बंद काटने से निकाल दिया जाता है। क़ीमा के बाद, नाड़ीग्रन्थि तो पाचन एंजाइमों कि डीआरजी न्यूरॉन्स, तो रिकॉर्डिंग से पहले कई दिनों के लिए तुरंत या सुसंस्कृत दर्ज किया जा सकता है, जो की हदबंदी में परिणाम में रखा गया है। दुर्भाग्य से, डीआरजी न्यूरॉन्स की हदबंदी perikarya के करीब एक आवश्यक axotomy शामिल है। एक बार अलग और axotomized, डीआरजी न्यूरॉन्स झिल्ली excitability 11,12 में प्ररूपी परिवर्तन के साथ ही परिवर्तन से गुजरना। कि आम तौर पर उन्हें घेर व्यक्तिगत न्यूरॉन्स की perikarya और उपग्रह glial कोशिकाओं के बीच संपर्क के नुकसान इन परिवर्तनों 13 में योगदान करने की संभावना है। न्यूरॉन्स और उपग्रह glial कोशिकाओं के बीच crosstalk शारीरिक स्थितियों में दोनों जरूरी है और अनुकूलन patholog करने में हैइस तरह के असभ्य दर्द 14,15 के लिए अग्रणी के रूप में उन राजनैतिक परिस्थितियों। यह न्यूरॉन्स और उपग्रह glial कोशिकाओं को एक अलग डीआरजी तैयारी का उपयोग कर के बीच बातचीत का अध्ययन करने के लिए चुनौतीपूर्ण होगा।
बरकरार DRGs, दूसरे हाथ पर, इन विवो की स्थिति के करीब हैं। पिछले कई वर्षों में, हमारी प्रयोगशाला, साथ ही कुछ अन्य समूहों, वयस्क चूहों से बरकरार DRGs का उपयोग किया गया पुराने दर्द 3-5,11,15-17 के साथ जुड़े विभिन्न परिस्थितियों में प्राथमिक संवेदी न्यूरॉन्स के परिवर्तन की जांच करने के लिए। हालांकि इन अध्ययनों में इस्तेमाल की तकनीक कुछ हद तक स्थापित कर रहे हैं, एक कदम-दर-कदम विवरण अभी तक प्रकाशित नहीं किया गया है। वर्तमान पांडुलिपि में, हम बरकरार DRGs और पैच दबाना रिकॉर्डिंग के लिए उनके उपयोग को तैयार करने के लिए एक सुविधाजनक और तेजी से रास्ते का वर्णन है।
Protocol
Representative Results
Discussion
हम पैच दबाना अध्ययन के लिए पूरे DRGs तैयार करने के लिए एक विधि की रिपोर्ट। वहाँ एक आदर्श नमूना तैयार करने के लिए कई महत्वपूर्ण तत्व हैं। सबसे पहले, यह पृष्ठीय जुड़ी जड़ों के साथ DRGs टुकड़े करना महत्वपूर्ण ह?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to acknowledge the Painless Research Foundation for support of the work. This work was also supported by the NIH grants R01 NS080921-01 and R21 NS079897-01A1.
Materials
| Pentobarbital sodium | vortech Pharmaceuticals | ||
| syringe | BD | 309659 | 1 ml, 5 ml. |
| scalpel | BD | size: 15 | |
| Mayo straight scissor | Fine Science Tools | 14010-15 | |
| Mayo curved scissor | Fine Science Tools | 14011-15 | |
| Rongeur | Fine Science Tools | 16021-14 | |
| Adson toothed forceps | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Iris Scissor | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Noyes spring scissor | Fine Science Tools | 15124-12 | |
| Bone scissors | Fine Science Tools | 16044-10 | Special for cutting the bones. |
| Forceps: Dumont, Dumoxel Biologie #5 | Fine Science Tools | 11252-30 | These have the fine tips that do not need sharpening when first purchased. |
| periosteal elevator | Sklar | 97-0530 | |
| Dissection microscope | WILD | ||
| Transfer pipette | Fisher brand | 13-711-5AM | |
| Petri dish (10 cm) | Pyrex | Glass petri dish can avoid damaging the tips of fine forceps | |
| Collagenase (Liberase TM) | Roche | 05-401-119-001 | dissolve at the concentration of 13 u/ml, aliquot into glass pipette. Avoid repeated freeze and thaw. |
| filter | Thermo scientific | 7232520 | Filter the internal solutions for patch clamp recording to avoid clog. |
| Glass pipette | Sutter | BF150-110-7.5 | |
| Anchor | Havard apparatus | 64-0250 | stabilize the DRG to avoid drift. |
| Peristaltic pump | WPI | ||
| Pipette puller | Sutter | P97 | |
| Amplifier | Molecular devices | Axopatch 200B | |
| Digitizer | Molecular devices | 1440D | |
| Microscope | NIKON | FN600 | |
| Micro-manipulator | Sutter | MPC200 | |
| microinjection dispense system | General Valve | Picrospitzer II | fast drug application system |
| Carbogen (95% O2, 5% CO2) | Local Medical Gas supplier |
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