Patch Clamp Recordings på Intakt Dorsal margen fra voksne rotter
Summary
This manuscript describes how to prepare intact dorsal root ganglia for patch clamp recordings. This preparation maintains the microenvironment for neurons and satellite glial cells, thus avoiding the phenotypic and functional changes seen using dissociated DRG neurons.
Abstract
Patch klemme studier fra ryggmargen (DRG) neuroner har økt vår forståelse av det perifere nervesystemet. Foreløpig er de fleste av opptakene gjennomført på dissosierte DRG nevroner, som er en standard forberedelse for de fleste laboratorier. Neuronal egenskaper, men kan endres ved aksonal skade som følge av enzymoppløsning som brukes i å skaffe dissosierte neuroner. Videre kan dissosierte nervemidler, ikke fullt ut representerer mikromiljøet av DRG-siden tap av kontakt med satellitt gliaceller som omgir de primære sensoriske nevroner er en uunngåelig konsekvens av denne metoden. For å overvinne begrensninger i bruk av konvensjonelle dissosierte DRG nevroner for patch clamp opptak, i denne rapporten beskriver vi en metode for å forberede intakte DRG og gjennomføre patch clamp opptak på enkelt primære sensoriske nerveceller ex vivo. Denne tilnærmingen tillater rask og enkel tilberedning av intakte DRG, hermet ivivo betingelser ved å holde DRG nevroner i forbindelse med sine omkringliggende satellitt gliaceller og basalmembran. Videre unngår fremgangsmåten aksonal skade fra håndtering og enzymbehandling, for eksempel ved å dissosiere DRG. Denne eks vivo preparat kan i tillegg brukes til å studere interaksjonen mellom primære sensoriske neuroner og satellitt gliaceller.
Introduction
Sensation er avgjørende for en organismes overlevelse og velvære. Transmisjonen av stimuli er avhengig av de sensoriske baner som starter på omkretsender av axoner fra primære sensoriske nevroner. Primære sensoriske neuroner, med unntak av mesencefalisk kjernen av trigeminal nerve, er plassert i den trigeminal ganglia og dorsale rotganglier (DRG). De tjener som portvoktere for sensorisk informasjon 1. På perikarial membran, akkurat som på de sentrale og perifere terminaler, DRG nevroner uttrykker reseptorer og ionekanaler, som for eksempel glutamat reseptorer, TNF alfa-reseptorene, transient receptor potensielle kasjon kanal underfamilie V medlem 1 (TRPV1), natriumkanaler, etc. 2 -7. Patch klemme opptak av perikarial membranen tillater forstå funksjonelle endringer på mange av disse reseptorene og kanaler i hele nervecellen.
Plasteret klemme opptaksteknikk er et kraftig verktøy for studøende virksomhet kanaler eller reseptorer og et stort antall studier har blitt utført ved å bruke denne teknikken på DRG nevroner 8-10. I de fleste studiene DRG fjernes ved å kutte dorsal rootlets og spinal nerve nær ganglion. Etter hakking, blir ganglion deretter plassert i fordøyelsesenzymer som fører til dissosiasjon av DRG-neuroner, som kan deretter bli tatt opp umiddelbart eller dyrket i flere dager før opptak. Dessverre er dissosiasjon av DRG-neuroner innebærer en nødvendig aksotomi nær perikarya. Når dissosiert og axotomized, DRG nevroner gjennomgå fenotypiske endringer samt endringer i membran oppstemthet 11,12. Tapet av kontakt mellom perikarya av individuelle neuroner og satellitt gliaceller som normalt omgir dem er egnet til å bidra til disse endringene 13. Crosstalk mellom nevroner og satellitt gliaceller er både viktig i fysiologiske forhold og i tilpasning til pathologiCal forhold som de som fører til vanskelige smerter 14,15. Det ville være utfordrende å studere samspillet mellom nevroner og satellitt gliaceller ved hjelp av en dissosiert DRG forberedelse.
Intakte DRG, på den annen side, gir nærmere in vivo-betingelser. I de siste årene har vårt laboratorium, samt noen andre grupper, brukt intakte DRG fra voksne rotter for å undersøke endringer av primære sensoriske nevroner i ulike forhold knyttet til kroniske smerter 3-5,11,15-17. Selv om teknikker som brukes i disse studiene er noe etablert, en steg-for-steg beskrivelse er ennå ikke publisert. I den nåværende manuskriptet, beskriver vi en enkel og rask måte å forberede intakte DRG og deres bruk for patch clamp opptak.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi rapporterer en metode for å forberede hele DRG for patch clamp studier. Det er flere viktige elementer for å forberede en ideell prøven. For det første er det viktig å dissekere DRG med Dorsalrøttene vedlagt. Etter det må den epineurium fjernes forsiktig mens du unngår skade på nerveceller. Til slutt, for å eksponere de nevroner og deres omkringliggende satellitt gliaceller, er det nødvendig å fordøye den resterende bindevev. Intakte DRG fra voksne rotter tilberedt med metoden beskrevet her vil opprettho…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to acknowledge the Painless Research Foundation for support of the work. This work was also supported by the NIH grants R01 NS080921-01 and R21 NS079897-01A1.
Materials
| Pentobarbital sodium | vortech Pharmaceuticals | ||
| syringe | BD | 309659 | 1 ml, 5 ml. |
| scalpel | BD | size: 15 | |
| Mayo straight scissor | Fine Science Tools | 14010-15 | |
| Mayo curved scissor | Fine Science Tools | 14011-15 | |
| Rongeur | Fine Science Tools | 16021-14 | |
| Adson toothed forceps | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Iris Scissor | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Noyes spring scissor | Fine Science Tools | 15124-12 | |
| Bone scissors | Fine Science Tools | 16044-10 | Special for cutting the bones. |
| Forceps: Dumont, Dumoxel Biologie #5 | Fine Science Tools | 11252-30 | These have the fine tips that do not need sharpening when first purchased. |
| periosteal elevator | Sklar | 97-0530 | |
| Dissection microscope | WILD | ||
| Transfer pipette | Fisher brand | 13-711-5AM | |
| Petri dish (10 cm) | Pyrex | Glass petri dish can avoid damaging the tips of fine forceps | |
| Collagenase (Liberase TM) | Roche | 05-401-119-001 | dissolve at the concentration of 13 u/ml, aliquot into glass pipette. Avoid repeated freeze and thaw. |
| filter | Thermo scientific | 7232520 | Filter the internal solutions for patch clamp recording to avoid clog. |
| Glass pipette | Sutter | BF150-110-7.5 | |
| Anchor | Havard apparatus | 64-0250 | stabilize the DRG to avoid drift. |
| Peristaltic pump | WPI | ||
| Pipette puller | Sutter | P97 | |
| Amplifier | Molecular devices | Axopatch 200B | |
| Digitizer | Molecular devices | 1440D | |
| Microscope | NIKON | FN600 | |
| Micro-manipulator | Sutter | MPC200 | |
| microinjection dispense system | General Valve | Picrospitzer II | fast drug application system |
| Carbogen (95% O2, 5% CO2) | Local Medical Gas supplier |
References
- Basbaum, A. I., Bautista, D. M., Scherrer, G., Julius, D. Cellular and molecular mechanisms of pain. Cell. 139, 267-284 (2009).
- Caterina, M. J., et al. The capsaicin receptor: a heat-activated ion channel in the pain pathway. Nature. 389, 816-824 (1997).
- Gong, K., Bhargava, A., Jasmin, L. GluN2B N-methyl-D-aspartate receptor and excitatory amino acid transporter 3 are upregulated in primary sensory neurons after 7 days of morphine administration in rats: implication for opiate-induced hyperalgesia. Pain. 157, 147-158 (2016).
- Gong, K., Kung, L. H., Magni, G., Bhargava, A., Jasmin, L. Increased response to glutamate in small diameter dorsal root ganglion neurons after sciatic nerve injury. PloS one. 9, 95491 (2014).
- Gong, K., Zou, X., Fuchs, P. N., Lin, Q. Minocycline inhibits neurogenic inflammation by blocking the effects of tumor necrosis factor-alpha. Clin Exp Pharmacol Physiol. , (2015).
- Ohtori, S., Takahashi, K., Moriya, H., Myers, R. R. TNF-alpha and TNF-alpha receptor type 1 upregulation in glia and neurons after peripheral nerve injury: studies in murine DRG and spinal cord. Spine. 29, 1082-1088 (2004).
- Waxman, S. G., Cummins, T. R., Dib-Hajj, S., Fjell, J., Black, J. A. Sodium channels, excitability of primary sensory neurons, and the molecular basis of pain. Muscle nerve. 22, 1177-1187 (1999).
- Zhang, J. M., Song, X. J., LaMotte, R. H. Enhanced excitability of sensory neurons in rats with cutaneous hyperalgesia produced by chronic compression of the dorsal root ganglion. J Neurophysiol. 82, 3359-3366 (1999).
- Dib-Hajj, S. D., et al. Plasticity of sodium channel expression in DRG neurons in the chronic constriction injury model of neuropathic pain. Pain. 83, 591-600 (1999).
- Cummins, T. R., et al. A novel persistent tetrodotoxin-resistant sodium current in SNS-null and wild-type small primary sensory neurons. J Neurosci. 19, RC43 (1999).
- Zheng, J. H., Walters, E. T., Song, X. J. Dissociation of dorsal root ganglion neurons induces hyperexcitability that is maintained by increased responsiveness to cAMP and cGMP. J Neurophysiol. 97, 15-25 (2007).
- Schoenen, J., Delree, P., Leprince, P., Moonen, G. Neurotransmitter phenotype plasticity in cultured dissociated adult rat dorsal root ganglia: an immunocytochemical study. J Neurosci Res. 22, 473-487 (1989).
- Hanani, M. Satellite glial cells: more than just ‘rings around the neuron’. Neuron Glia Biol. 6, 1-2 (2010).
- Takeda, M., Nasu, M., Kanazawa, T., Shimazu, Y. Activation of GABA(B) receptors potentiates inward rectifying potassium currents in satellite glial cells from rat trigeminal ganglia: in vivo patch-clamp analysis. Neurosciences. 288, 51-58 (2015).
- Zhang, H., et al. Altered functional properties of satellite glial cells in compressed spinal ganglia. Glia. 57, 1588-1599 (2009).
- Fan, N., Donnelly, D. F., LaMotte, R. H. Chronic compression of mouse dorsal root ganglion alters voltage-gated sodium and potassium currents in medium-sized dorsal root ganglion neurons. J Neurophysiol. 106, 3067-3072 (2011).
- Fan, N., Sikand, P., Donnelly, D. F., Ma, C., Lamotte, R. H. Increased Na+ and K+ currents in small mouse dorsal root ganglion neurons after ganglion compression. J Neurophysiol. 106, 211-218 (2011).
- Sherman-Gold, R. . The Axon Guide. , (2008).
- Cummins, T. R., Rush, A. M., Estacion, M., Dib-Hajj, S. D., Waxman, S. G. Voltage-clamp and current-clamp recordings from mammalian DRG neurons. Nat Protoc. 4, 1103-1112 (2009).
- Zhang, J. M., Donnelly, D. F., LaMotte, R. H. Patch clamp recording from the intact dorsal root ganglion. J Neurosci Methods. 79, 97-103 (1998).
- Benn, S. C., Costigan, M., Tate, S., Fitzgerald, M., Woolf, C. J. Developmental expression of the TTX-resistant voltage-gated sodium channels Nav1.8 (SNS) and Nav1.9 (SNS2) in primary sensory neurons. J Neurosci. 21, 6077-6085 (2001).
- Funakoshi, K., et al. Differential development of TRPV1-expressing sensory nerves in peripheral organs. Cell Tissue Res. 323, 27-41 (2006).
- Hayar, A., Gu, C., Al-Chaer, E. D. An improved method for patch clamp recording and calcium imaging of neurons in the intact dorsal root ganglion in rats. J Neurosci Methods. 173, 74-82 (2008).
- Yagi, J., Sumino, R. Inhibition of a hyperpolarization-activated current by clonidine in rat dorsal root ganglion neurons. J Neurophysiol. 80, 1094-1104 (1998).
- Ma, C., Donnelly, D. F., LaMotte, R. H. In vivo visualization and functional characterization of primary somatic neurons. J Neurosci Methods. 191, 60-65 (2010).
- Vit, J. P., Jasmin, L., Bhargava, A., Ohara, P. T. Satellite glial cells in the trigeminal ganglion as a determinant of orofacial neuropathic pain. Neuron Glia Biol. 2, 247-257 (2006).
