이미징 유동 세포 계측법에 의해 인간 단핵구 유래 수지상 세포의 특성 : 두 단핵구 격리 프로토콜 사이의 비교
Summary
This study compares two different methods of human monocyte isolation for obtaining in vitro dendritic cells (DCs). Monocytes are selected by adherence or negatively enriched by magnetic separation. Monocyte yield and viability along with MDDC viability, proliferation and CD11c/CD14 surface marker expression will be compared between both methods.
Abstract
Dendritic cells (DCs) are antigen presenting cells of the immune system that play a crucial role in lymphocyte responses, host defense mechanisms, and pathogenesis of inflammation. Isolation and study of DCs have been important in biological research because of their distinctive features. Although they are essential key mediators of the immune system, DCs are very rare in blood, accounting for approximately 0.1 – 1% of total blood mononuclear cells. Therefore, alternatives for isolation methods rely on the differentiation of DCs from monocytes isolated from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs). The utilization of proper isolation techniques that combine simplicity, affordability, high purity, and high yield of cells is imperative to consider. In the current study, two distinct methods for the generation of DCs will be compared. Monocytes were selected by adherence or negatively enriched using magnetic separation procedure followed by differentiation into DCs with IL-4 and GM-CSF. Monocyte and MDDC viability, proliferation, and phenotype were assessed using viability dyes, MTT assay, and CD11c/ CD14 surface marker analysis by imaging flow cytometry. Although the magnetic separation method yielded a significant higher percentage of monocytes with higher proliferative capacity when compared to the adhesion method, the findings have demonstrated the ability of both techniques to simultaneously generate monocytes that are capable of proliferating and differentiating into viable CD11c+ MDDCs after seven days in culture. Both methods yielded > 70% CD11c+ MDDCs. Therefore, our results provide insights that contribute to the development of reliable methods for isolation and characterization of human DCs.
Introduction
수지상 세포 (DC가)는 타고난 및 적응 면역 시스템의 중요한 매개체이다. 이들은 차 면역 반응을 유도하는 면역 학적 기억의 개발을 용이하게하는 기능을한다. 이러한 세포는 항원을 포획, 마이그레이션 및 T 세포 자극을 주로 담당하므로 수지상 .Manipulation 다른 치료 연구의 다양한 분야에 걸쳐 상기 임상 환경에서 이용 될 수있는 한 같은 전문 항원 제시 세포 (APC를)라고 이러한 HIV 6,7 암 (8)과 같은 염증성 질환,자가 면역 질환 9 및 알레르기 반응 (10). 수지상은 또한 알코올 의존 11-14, 13, 15, 약물 의존성, 및 HIV 감염 및 약물 남용 16-19의 조합과 관련된 것과 같은 미지의 메커니즘 경로를 해결하기 위해 약물 남용 연구에 이용되고있다. 이러한 지속적인 연구와 미래 연구 조사 전n은 면역학 분야의 연구에 매우 중요한 수지상 세포의 체외 세대합니다. 총 혈액 단핵 세포 (20)의 1 % – 그러나, 이들이 0.1를 구성하는 인간 혈액 수지상 세포 분리와 연관된 여러 가지 어려움이있다.
지금까지 DC가 체외의 생성에 대한 확립 된 방법 중 일부는 (22) 자기 활성 셀 정렬, 형광 활성화 된 셀 정렬로 단핵 세포 (21, 22)의 플라스틱이나 유리 준수, 밀도 기울기 원심 분리 (23), 특정 마커 기반의 분리 구성 24, 덱스 트란 코팅 자성 나노 입자 (25), 및 완전 자동화 된 음의 셀 선택 (26)를 사용하여 고순도 단핵 세포의 신속한 분리를 사용하여 CD14 +의 단핵 세포의 긍정적 인 선택. 그러나 선택의 가장 좋은 방법은 논란이 남아있다. 따라서, DC 생성 기술을 개선하기 위해 다양한 방법이있는 개발되어왔다이러한 세포의 순도가 크게 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)로부터 단리 정제하여 27 CD34 + 조상 세포 및 단핵 세포의 분화에 의해 증가 될 수있다. 앞서 언급 한 바와 같이, 단핵구 유래 수지상 세포 (MDDCs)을 생성하는 광범위하게 사용되는 대중적인 방법은 유리 또는 플라스틱 (접착 방법) 21,22,27에 부착 단구의 능력을 조사하는 것이다. 접착력 방법은 복잡한 장비의 사용을 요구하지 않고 신속하고 간단한 방법이다. 그러나,이 방법의 단점은 림프구 오염, 낮은 유연성, 단핵구 과도 조작 (28)를 포함한다. 접착력 방법의 대체 방법은 특별히 음성 선별 (26)에 의해 한 PBMC로부터 단핵구를 분리하기 위해 디자인 된 인간 단핵구 보충 키트를 사용하여, 총 한 PBMC로부터 단핵구를 자기 분리한다. 이 절차를 수행하는 동안, 원치 않는 세포는 테트라와 제거를 대상으로항체 복합체 및 덱스 트란 코팅 된 자성 입자. 이 분리 방법의 장점은 원치 않는 표지화 된 세포가 표적 세포를 자유롭게 열 필요없이 새로운 튜브 속으로 주입 될 수 있지만 자석을 이용하여 분리되어 있다는 것이다. 지금까지 고유 한 세포 인구 레이블을 수있는 특정 단일 클론 항체의 가용성, 자기 분리 기술은 추가 방법,하지만 면역학 분야의 희귀 세포의 분리에 대한 필요성 단순히되고있다. 예를 들면, 자기 셀과 같은 기술 연구 및 임상 응용 22,29 새로운 방법의 개발을 용이 한 시판 상자성 나노 입자-MACS 선별. 또한, 단핵구의 부착 및 MACS 기술 방법에서 DC 생성을 비교하는 최근의 연구 조사는 단핵 세포 22,30 분리 MACS를 사용하여 더 높은 DC 순도 및 생존 능력을 증명하고있다.
본 연구의 선물상업용 인간 단핵구 보충 키트를 사용하여 접착 한) 단핵 세포 분리 및 2) 단핵 세포 분리 음성 선별 기준 : PBMC를 분리 인간 단핵구로부터 수지상 세포의 생성에 대한 두 가지 방법의 비교. 이 연구는 부착 방법에 의해 고립 된 단핵구와 비교했을 때 단핵구를 분리 할 수있는 음의 선택 자기 분리 절차는 단핵 세포 생존 능력에 유의 한 차이 단핵 세포의 가장 높은 수율을 생성하는 보여주는 증거를 제공합니다. 차례로, 7 일 후에, 자기 분리에 의해 고립 된 단핵구는 MDDC 생존에 영향을주지 않고 상당히 높은 증식 능력과 더블 플러스 (중 CD11c + / CD14 +) 표현형을 발현하는 세포의 높은 양의 MDDCs로 분화. 그것은 동시에 증식과의 CD11c로 분화 할 수있는 단핵 세포를 생성하는 두 가지 기술의 능력을 입증 때문에 전체적으로 현재 연구 + 위에서 언급 한 선행 연구와 다르다자신의 가능성을 손상시키지 않고 문화 7 일 후에 MDDCs (> 70 %). 또한, 현재의 방법은 유동 세포 계측법 촬상 다를은 CD11c / CD14 MDDCs는 인구의 처음 특성을 제공한다.
수지상은 면역학 분야의 연구에 관한 초점 역할 때문에 이들이 유도 된 어떤 방법은 시험관 내에서 이들을 분리하고 배양하기 위해 사용되는 방법을 고려하면 요약하면, 다른 파라미터가 고려되어야한다. 따라서 본 연구는 두 가지 단핵구 분리 방법 및 방법이 방법은 차등 결국 수지상 세포 생존, 증식 및 단핵구의 표현형에 영향을 생존 및 수율에 영향을 통찰력을 제공하는 것을 목적으로한다. 이러한 발견은 면역학 분야에 크게 기여하고 DC 분리, 정제 및 특성에 대한 상세한 프로토콜을 제공한다.
Protocol
Representative Results
Discussion
단리 인간 혈액으로부터 MDDCs를 생성하는 알려진 문제에 기초하여, 본 연구는 MDDCs의 생성이 잘 확립 된 방법의 포괄적 인 비교를 제공하는 것을 목표로. 비교 첫 번째 방법은 유리 또는 플라스틱 (접착 방법) 21,22,27에 부착 단구의 능력을 이용하여 MDDCs을 생성하는 잘 정립 된 전통적인 방법이다. 접착력 방법은 빠르고 효과적인 비용 및 복잡한 장비의 사용을 요구하지 않는다. 그러나,이 방…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research is supported by the National Institute on Alcohol Abuse and Alcoholism, award K99/R00 AA021264. Additional lab support as part of startup package has been received from the Department of Immunology, Institute of NeuroImmune Pharmacology, Herbert Wertheim College of Medicine, and FIU- Office of Research and Economic Development. Gianna Casteleiro was supported by NIH/NIGMS R25 GM061347. The content is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the official views of the National Institutes of Health.
Materials
| Ficoll-Paque | GE Healthcare | 17-5442-03 | Must be used at room temperature |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Life Technologies | 10010-023 | |
| ACK Lysing buffer | Quality Biological | 118-156-101 | |
| RPMI 1640 medium | Life Technologies | 22400-089 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Life Technologies | 15240-062 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies | 16000-044 | |
| RoboSep buffer | StemCell | 20104 | |
| EasySep Human monocyte enrichment kit | StemCell | 19059 | |
| TC20 Automated cell counter | Bio-Rad | 145-0101 | |
| FITC-Dextran | Sigma Aldrich | FD4-100MG | |
| Trypan blue stain (0.4%) | Life Technologies | 15250-061 | |
| Synergy 2 multi-mode reader | Biotek | 7131000 | |
| XTT Sodium salt bioreagent (XTT) | Sigma Aldrich | X4626-100MG | |
| Dimethyl sulfoxide bioreagent (DMS) | Sigma Aldrich | D8418-500ML | |
| Thiazolyl blue tetrazolium bromide (MTT) | Sigma Aldrich | m5655-500MG | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Bio-Rad | 161-0302 | |
| Phenazine Methosulfate (DMSO) | Sigma Aldrich | P9626-1G | |
| Inactivated (HI) Human Serum | Chemicon | S1-100ML | |
| Accuri C6 Flow Cytometer | BD Accuri | 653119 | |
| FlowSight Amnis Flow Cytometer | EMD Millipore | 100300 |
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