Высокая-контент<em> In Vitro</em> Панкреатическими островками β-клеток репликации Discovery Platform
Summary
Критические проблемы для области исследования диабета должны понять молекулярные механизмы, которые регулируют репликацию β-клеток островков и разработать методы стимуляции регенерации β-клеток. При этом метод высокого содержания скрининга для выявления и оценки репликации способствующего активности β-клеток малых молекул представлена.
Abstract
Loss of insulin-producing β-cells is a central feature of diabetes. While a variety of potential replacement therapies are being explored, expansion of endogenous insulin-producing pancreatic islet β-cells remains an attractive strategy. β-cells have limited spontaneous regenerative activity; consequently, a crucial research effort is to develop a precise understanding of the molecular pathways that restrain β-cell growth and to identify drugs capable of overcoming these restraints. Herein an automated high-content image-based primary-cell screening method to identify β-cell replication-promoting small molecules is presented. Several, limitations of prior methodologies are surmounted. First, use of primary islet cells rather than an immortalized cell-line maximizes retention of in vivo growth restraints. Second, use of mixed-composition islet-cell cultures rather than a β-cell-line allows identification of both lineage-restricted and general growth stimulators. Third, the technique makes practical the use of primary islets, a limiting resource, through use of a 384-well format. Fourth, detrimental experimental variability associated with erratic islet culture quality is overcome through optimization of isolation, dispersion, plating and culture parameters. Fifth, the difficulties of accurately and consistently measuring the low basal replication rate of islet endocrine-cells are surmounted with optimized immunostaining parameters, automated data acquisition and data analysis; automation simultaneously enhances throughput and limits experimenter bias. Notable limitations of this assay are the use of dispersed islet cultures which disrupts islet architecture, the use of rodent rather than human islets and the inherent limitations of throughput and cost associated with the use of primary cells. Importantly, the strategy is easily adapted for human islet replication studies. This assay is well suited for investigating the mitogenic effect of substances on β-cells and the molecular mechanisms that regulate β-cell growth.
Introduction
Диабет включает в себя совокупность расстройств, разделяющих общую конечную точку нарушенного гомеостаза глюкозы. Хотя патогенетические механизмы диабета подтипов различны, они имеют следствием пониженной β-клеточной массы, то есть, потери производства инсулина мощностью 1,2. В настоящее время стратегии лечения диабета полагаются на хроническое введение экзогенного инсулина, фармакологической стимуляции выработки инсулина или повышения чувствительности к инсулину, и редко, трансплантация островков поджелудочной железы или всей поджелудочной железы 3,4. К сожалению, успех этих стратегий является кратковременным и / или не в достаточной степени перепросматривать функцию эндогенного инсулина. Несмотря на полезность разработки метода для стимуляции регенерации β-клеток, ни один такой подход не существует. Следовательно, главная цель исследования диабета заключается в разработке методов для создания новых бета-клеток или расширить эндогенного β-клеточной массы 5 </sup>. Хотя регенерации β-клеток из возобновляемых источников , таких как эмбриональные стволовые клетки развивается, безопасность и эффективность проблемы делают преследование альтернативных стратегий, в том числе расширение зрелых бета-клеток, приоритет 6,7. Важно отметить, что основным источником новых бета-клеток в естественных условиях предварительно существующие бета-клеток , а не специализированные клетки – предшественники 8,9. Хотя бета-клетки, кажется, имеют ограниченные возможности репликации, небольшое увеличение массы β-клеток (~ 30%) может быть достаточно, чтобы восстановить гомеостаз глюкозы во многих диабетиков. Кроме того, на месте фармакологической стимуляции массы β-клеток в потенциально недорогой и масштабируемая стратегия лечения. При этом метод скрининга высокого содержания для идентификации и характеристике небольших молекул, которые стимулируют рост β-клеток представлена.
Разнообразие экспериментальных методов в пробирке , могут быть использованы для идентификации генных продуктов и / или молекулы ТНАт способствуют репликации первичного β-клеток. Ранние попытки для измерения индукции репликации β-клеток использовали плода культуры грызун поджелудочных желез или неповрежденные культуры изолированных островковых для измерения [3 H] тимидина, BrdU включение или митотических тела в пределах альдегид-тионина или инсулина , окрашенном населения в ответ на конкретные условия обработки 10, 11. Эти подходы в пробирке и близкие его варианты имеют ряд ограничений. Известные недостатки включают в себя (1) использование эмбриональных клеток , которые, в отличие от зрелых бета-клеток, демонстрируют высокую скорость репликации базальной β-клетки и рост регулируется в различимыми 12; (2) субъективный характер экспериментатора-зависимого судебного решения событий репликации β-клеток; (3) труд и время интенсивного характера экспериментатора-зависимого подсчета событий репликации β-клеток замедл экспериментальную пропускную способность; (4) использование ядерного инкорпорации / пятно / внешний вид, чтобы идентифицировать репликацию дажеTS и не перекрываются цитоплазматический краситель для выявления бета-клеток приводит к приписывание уточненного событий репликации не-β-клеток в бета-клетки.
Совсем недавно зрелые первичные бета-клетки были использованы для оценки влияния трансгенов избыточная экспрессия, а также продукт гена или соединение лечения на репликацию β-клеток 13-16. Тем не менее, эти исследования также полагались на субъективном подсчета событий репликации, цитоплазматический staining- или неспецифических методов идентификации β-клеток и / или трудоемких шагов , которые ограничивают пропускную способность , например, индивидуальный слайд-луночного покрытия клеток или неповрежденной островок парафин и обработка 17. Следует отметить, что человеческий β-клеток методологии скрининга репликации на основе изображений, похожий на тот , представленный здесь, был опубликован 18; Тем не менее, успешное использование этого анализа не было продемонстрировано и использование человеческих островки для первичного скрининга не может быть широко FEAскорее.
Альтернативной стратегией для выявления репликации промотирующее веществ для оценки индукции роста β-клеточных линий. Первоначальные усилия использовали трансформированных бета-клеточные линии , такие как min6 клетки или INS 832/13-клетки 14,19-21. Тем не менее, эти клеточные линии демонстрируют-безудержный рост и имеют мало общего с хорошо дифференцированных -клеток 22. Следовательно, рост индукции мощность минимальна, неясного отношение и иногда трудно пересказать. Улучшенная стратегия для скрининга на основе клеточной линии утилизирует "обратимо трансформировали" клетки, рост арестованы в отсутствие тетрациклина (доксициклин) экспрессия 23,24 антигена -зависимая SV40 T. Тем не менее, неясно, будет ли вернуть эти клетки к "нормальной" β-клеток, как состояние после удаления доксициклина. К сожалению, использование этих клеток дало обобщенные стимулирующие рост соединений, которые, кажется, не имеют немедленного утилиты24. В целом, использование клеточных линий для изучения регуляции роста клеток типа , где отображаются минимальное спонтанную активность репликации может иметь ограниченную применимость.
Репликации скрининга платформы β-клеток , представленные здесь используют зрелые первичные крысы бета-клетки , чтобы сохранить в регуляции роста естественных условиях в максимально возможной степени, островок-клеточные культуры состава смешанного клеточного типа , который позволяет идентифицировать деятельности , способствующих росту LINEAGE-ограниченным, мульти -ну форматирование, чтобы максимизировать пропускную способность и автоматизированный анализ для устранения смещения и облегчить пропускную способность. Успешное использование этой платформы позволило выявить несколько соединений , которые способствуют репликации β-клеток 25,26. Кроме того, исследование было использовано для изучения зависимости структура-активность и химических экспериментов эпистазу обеспечить механистических понимание молекулярной регуляции репликации β-клеток. Представленная платформа была успешно адаптирована FOг лентивирусов RNAi на основе исследование репликации β-клеток дорожками 25. Ограничения анализа включают ограниченный масштабируемость (использование первичных клеток), использование грызуна, а не человеческих островковых клеток (хотя анализ может быть адаптирован для исследования островковых человека), расходы, связанные с изображениями на основе антител и использование первичного островкового, использование дисперсных островках (нарушена островок архитектуры), чтобы облегчить автоматизированное получение изображений и зависимость от наличия автоматизированного микроскопа с приобретением изображения и возможности анализа. Несмотря на то, снисходительный в естественных условиях методики скрининга для выявления генных продуктов или соединений , которые стимулируют регенерацию β-клеток на месте было бы идеально, такая платформа еще не доступна 27. Следовательно, описанная платформа подходит для исследователя, заинтересованного в исследовании большинство аспектов репликации β-клеток.
Protocol
Representative Results
Discussion
Экспериментальные методы исследования молекулярных путей, которые контролируют рост β-клеток и регенерации являются важными инструментами для исследователей диабета. При этом, крыса-островок на основе скрининга платформа для идентификации и характеристики малых молекул стимулятор…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by NIDDK grants DK098143 and DK101530 from the NIH (JPA), Stanford’s Spectrum Child Health Research Institute (CHRI) and SPARK (UL1 TR001085, JPA).
Materials
| 250g male Male Sprague Dawly Rat | Charles River | Stain # 400 | |
| 12 cm teeth tisuue forceps | Fine Science Tools | 11021-12 | |
| 11.5 cm fine scissors | Fine Science Tools | 14058-11 | |
| 14.5 cm surgical scissors | Fine Science Tools | 14001-14 | |
| 16 cm curved forceps | Fine Science Tools | 11003-16 | |
| 12 cm curved hepostat | Fine Science Tools | 13011-12 | |
| 12 cm scalpel handle | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Tissue sieve-30 mesh | Bellco Glass | 1985-85000 | |
| Cizyme RI, 375,000 CDA units | VitaCyte | 005-1030 | |
| Hanks' Balanced Salt solution (Ca++ and Mg++) | Gibco | 24020-117 | |
| Ketamine HCl (200 mg/20 ml) | JHP Pharmaceuticals | NDC# 42023-113-10 | to make anesthetic cocktail |
| Xylazine (5 g/50 ml) | LLOYD | NADA# 139-236 | to make anesthetic cocktail |
| Histopaque 1077 | Sigma | H-1077 | to make histopaque 1100 |
| Histopaque 1119 | Sigma | H-1119 | to make histopaque 1100 |
| Newborn Calf Serum 500 ml | Hyclone | SH30118.03 | |
| Hanks' Balanced Salt solution | Hyclone | SH30268.01 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium/Low Glucose | Hyclone | SH30021.01 | |
| Functionality/Viability Solution | Mediatech | 99-768-CV | |
| RPMI1640 media | Hyclone | SH30096.01 | to make conditioned medium |
| 804G rat bladder carcinoma cell-line | Available upon request | to make conditioned medium | |
| Fetal Bovine Serum, Qualified | Gibco | 26160 | |
| GlutaMax-I | Gibco | 35050-061 | |
| Penicillin (5,000 IU/ml/Strptomycin (5 mg/ml) | MP Biomedicals | 1670049 | |
| Formamide 500 mL | Fisher BioReagents | BP227-500 | |
| Antigen Unmasking Solution 250 mL (PH 6.0) | Vector Laboratories | H-3300 | to make 0.15 M Sodium Sitrate solution |
| Dextrose, Anhydrous | EMD Chemicals | DX0145-1 | to make 1 M glucose solution |
| Nomal Donkey Serum (Powder) | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787-100ML | |
| Mouse anti-human Ki67 antibody | BD Biosciences | 556003 | |
| Goat anti-human PDX-1 antibody | R&D Systems | AF2419 | |
| Polyclonal Guinea Pig anti-insulin antibody | Dako | 2016-08 | |
| Polyclonal Rabbit anti-glucagon antibody | Dako | 2014-06 | |
| Polyclonal Rabbit anti-somatostatin antibody | Dako | 2011-08 | |
| Polyclonal chicken anti-vimentin antibody | abcam | ab24525 | |
| Biotin-SP-conjugated, Donkey Anti-Mouse IgG | Jackson ImmunoResearch | 715-065-150 | |
| StreptAvidin, Alex Flour 488 conjugated | Invitrogen | S32354 | |
| Rhodamine-conjugated Donkey Anti-Goat IgG | Jackson ImmunoResearch | 705-025-147 | |
| Rhodamine-conjugated Donkey Anti-Guinea Pig IgG | Jackson ImmunoResearch | 706-025-148 | |
| Rhodamine-conjugated Donkey Anti-Rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch | 711-025-152 | |
| Cy 5-conjugated Donkey Anti-Guinea Pig IgG | Jackson ImmunoResearch | 706-175-148 | |
| Cy 5-conjugated Donkey Anti-Goat IgG | Jackson ImmunoResearch | 705-175-147 | |
| Cy 5-conjugated Donkey Anti-Rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch | 711-175-152 | |
| Cy 5-conjugated Donkey Anti-Chicken IgG | Jackson ImmunoResearch | 703-175-155 | |
| DAPI | Millipore | S7113 | |
| Disposable Reagent Reservoir 25 mL | Sorenson BioScience | 39900 | |
| 384 well, black/clear, tissue culture treated plate | BD Falcon | 353962 | |
| 96 well, black/clear, tissue culture treated plate | Costar | 3603 | |
| Multi-channel pipettor | Costar | 4880 | |
| 12-channel vaccume aspirator | Drummond | 3-000-096 | |
| Cell Scraper | Falcon | 353085 | |
| Isotemp Water Bath Model 2223 | Fisher Scientific | ||
| High-content screening instrument: ArrayScan VTI | Thermo Scientific |
References
- Butler, A. E., et al. Beta-cell deficit and increased beta-cell apoptosis in humans with type 2 diabetes. Diabetes. 52 (1), 102-110 (2003).
- Kloppel, G., Lohr, M., Habich, K., Oberholzer, M., Heitz, P. U. Islet pathology and the pathogenesis of type 1 and type 2 diabetes mellitus revisited. Surv Synth Pathol Res. 4 (2), 110-125 (1985).
- Harlan, D. M., Kenyon, N. S., Korsgren, O., Roep, B. O. Current advances and travails in islet transplantation. Diabetes. 58 (10), 2175-2184 (2009).
- Nath, D. S., et al. Outcomes of pancreas transplants for patients with type 2 diabetes mellitus. Clin Transplant. 19 (6), 792-797 (2005).
- Nichols, R. J., New, C., Annes, J. P. Adult tissue sources for new beta cells. Transl Res. 163 (4), 418-431 (2014).
- Pagliuca, F. W., et al. Generation of functional human pancreatic beta cells in vitro. Cell. 159 (2), 428-439 (2014).
- Kushner, J. A., MacDonald, P. E., Atkinson, M. A. Stem cells to insulin secreting cells: two steps forward and now a time to pause. Cell Stem Cell. 15 (5), 535-536 (2014).
- Dor, Y., Brown, J., Martinez, O. I., Melton, D. A. Adult pancreatic beta-cells are formed by self-duplication rather than stem-cell differentiation. Nature. 429 (6987), 41-46 (2004).
- Meier, J. J., et al. Beta-cell replication is the primary mechanism subserving the postnatal expansion of beta-cell mass in humans. Diabetes. 57 (6), 1584-1594 (2008).
- Chick, W. L., Lauris, V., Flewelling, J. H., Andrews, K. A., Woodruff, J. M. Effects of glucose on beta cells in pancreatic monolayer cultures. Endocrinology. 92 (1), 212-218 (1973).
- Brelje, T. C., Sorenson, R. L. Role of prolactin versus growth hormone on islet B-cell proliferation in vitro: implications for pregnancy. Endocrinology. 128 (1), 45-57 (1991).
- Chen, H., et al. PDGF signalling controls age-dependent proliferation in pancreatic beta-cells. Nature. 478 (7369), 349-355 (2011).
- Liu, H., et al. Glycogen synthase kinase-3 and mammalian target of rapamycin pathways contribute to DNA synthesis, cell cycle progression, and proliferation in human islets. Diabetes. 58 (3), 663-672 (2009).
- Metukuri, M. R., et al. ChREBP mediates glucose-stimulated pancreatic beta-cell proliferation. Diabetes. 61 (8), 2004-2015 (2012).
- Wang, P., et al. A high-throughput chemical screen reveals that harmine-mediated inhibition of DYRK1A increases human pancreatic beta cell replication. Nat Med. 21 (4), 383-388 (2015).
- Schisler, J. C., et al. Stimulation of human and rat islet beta-cell proliferation with retention of function by the homeodomain transcription factor Nkx6.1. Mol Cell Biol. 28 (10), 3465-3476 (2008).
- Fueger, P. T., Hernandez, A. M., Chen, Y. C., Colvin, E. S. Assessing replication and beta cell function in adenovirally-transduced isolated rodent islets. J Vis Exp. (64), (2012).
- Walpita, D., et al. A human islet cell culture system for high-throughput screening. J Biomol Screen. 17 (4), 509-518 (2012).
- Miyazaki, J., et al. Establishment of a pancreatic beta cell line that retains glucose-inducible insulin secretion: special reference to expression of glucose transporter isoforms. Endocrinology. 127 (1), 126-132 (1990).
- Song, W. J., et al. Phosphorylation and inactivation of glycogen synthase kinase 3beta (GSK3beta) by dual-specificity tyrosine phosphorylation-regulated kinase 1A (Dyrk1A). J Biol Chem. 290 (4), 2321-2333 (2015).
- Hohmeier, H. E., et al. Isolation of INS-1-derived cell lines with robust ATP-sensitive K+ channel-dependent and -independent glucose-stimulated insulin secretion. Diabetes. 49 (3), 424-430 (2000).
- Cozar-Castellano, I., et al. Lessons from the first comprehensive molecular characterization of cell cycle control in rodent insulinoma cell lines. Diabetes. 57 (11), 3056-3068 (2008).
- Efrat, S., Fusco-DeMane, D., Lemberg, H., aL Emran, O., Wang, X. Conditional transformation of a pancreatic beta-cell line derived from transgenic mice expressing a tetracycline-regulated oncogene. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (8), 3576-3580 (1995).
- Wang, W., et al. Identification of small-molecule inducers of pancreatic beta-cell expansion. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (5), 1427-1432 (2009).
- Annes, J. P., et al. Adenosine kinase inhibition selectively promotes rodent and porcine islet beta-cell replication. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (10), 3915-3920 (2012).
- Zhao, Z., et al. Repurposing cAMP-modulating medications to promote beta-cell replication. Mol Endocrinol. 28 (10), 1682-1697 (2014).
- Chen, C. A., Carolan, P. J., Annes, J. P. In vivo screening for secreted proteins that modulate glucose handling identifies interleukin-6 family members as potent hypoglycemic agents. PLoS One. 7 (9), e44600 (2012).
- Izumi, K., Hirao, Y., Hopp, L., Oyasu, R. In vitro induction of ornithine decarboxylase in urinary bladder carcinoma cells. Cancer Res. 41 (2), 405-409 (1981).
- Serup, P., et al. The homeodomain protein IPF-1/STF-1 is expressed in a subset of islet cells and promotes rat insulin 1 gene expression dependent on an intact E1 helix-loop-helix factor binding site. Biochem J. 310, 997-1003 (1995).
- Szabat, M., Luciani, D. S., Piret, J. M., Johnson, J. D. Maturation of adult beta-cells revealed using a Pdx1/insulin dual-reporter lentivirus. Endocrinology. 150 (4), 1627-1635 (2009).
- Rieck, S., et al. Overexpression of hepatocyte nuclear factor-4alpha initiates cell cycle entry, but is not sufficient to promote beta-cell expansion in human islets. Mol Endocrinol. 26 (9), 1590-1602 (2012).
- Wang, P., et al. Diabetes mellitus–advances and challenges in human beta-cell proliferation. Nat Rev Endocrinol. 11 (4), 201-212 (2015).
