En High-innhold<em> In Vitro</em> Bukspyttkjertelen Islet β-celle Replication Discovery Platform

Summary

Kritiske utfordringer for diabetes forskningsfeltet er å forstå de molekylære mekanismene som regulerer holmen β-celle replikering og å utvikle metoder for å stimulere β-celle gjenfødelse. Heri et høyt innhold av screening-metoden for å identifisere og vurdere β-celle-replikasjon-fremmende aktivitet av små molekyler er presentert.

Abstract

Loss of insulin-producing β-cells is a central feature of diabetes. While a variety of potential replacement therapies are being explored, expansion of endogenous insulin-producing pancreatic islet β-cells remains an attractive strategy. β-cells have limited spontaneous regenerative activity; consequently, a crucial research effort is to develop a precise understanding of the molecular pathways that restrain β-cell growth and to identify drugs capable of overcoming these restraints. Herein an automated high-content image-based primary-cell screening method to identify β-cell replication-promoting small molecules is presented. Several, limitations of prior methodologies are surmounted. First, use of primary islet cells rather than an immortalized cell-line maximizes retention of in vivo growth restraints. Second, use of mixed-composition islet-cell cultures rather than a β-cell-line allows identification of both lineage-restricted and general growth stimulators. Third, the technique makes practical the use of primary islets, a limiting resource, through use of a 384-well format. Fourth, detrimental experimental variability associated with erratic islet culture quality is overcome through optimization of isolation, dispersion, plating and culture parameters. Fifth, the difficulties of accurately and consistently measuring the low basal replication rate of islet endocrine-cells are surmounted with optimized immunostaining parameters, automated data acquisition and data analysis; automation simultaneously enhances throughput and limits experimenter bias. Notable limitations of this assay are the use of dispersed islet cultures which disrupts islet architecture, the use of rodent rather than human islets and the inherent limitations of throughput and cost associated with the use of primary cells. Importantly, the strategy is easily adapted for human islet replication studies. This assay is well suited for investigating the mitogenic effect of substances on β-cells and the molecular mechanisms that regulate β-cell growth.

Introduction

Diabetes omfatter en samling av forstyrrelser som deler den felles sluttpunkt forstyrret glukose homeostase. Selv om de patogene mekanismene for diabetes subtyper er adskilte, men de deler som følge av redusert β-cellemasse, dvs. tap av insulinproduksjonskapasitet ^1,2. I dag, diabetes behandlingsstrategier stole på kronisk administrering av eksogent insulin, farmakologisk stimulering av insulin produksjon eller forbedring av insulinfølsomhet, og sjelden, transplantasjon av pankreas holmer eller hele bukspyttkjertelen ^3,4. Dessverre, suksessen av disse strategiene er kortvarig og / eller unnlater å tilstrekkelig rekapitulere funksjonen av endogen insulinproduksjon. Til tross for anvendeligheten av å utvikle en metode for å stimulere β-celle regenerering, foreligger ingen slik tilnærming. Følgelig er et viktig diabetesforskning mål å utvikle metoder for å generere nye p-celler, eller for å utvide endogen β-cellemasse ⁵ </sup>. Selv β-celle gjenfødelse fra fornybare kilder som embryonale stamceller er fremme, sikkerhets- og effektivitetshensyn gjør jakten på alternative strategier, herunder utvidelse av modne p-celler, en prioritet ^6,7. Viktigere er den dominerende kilde til nye p-celler in vivo pre-eksisterende p-celler i stedet for spesialiserte stamceller ^8,9. Selv om p-celler synes å ha begrenset kapasitet replikasjon, en liten økning i β-cellemasse (~ 30%) kan være tilstrekkelig til å gjenopprette glukosehomeostase i mange diabetikere. Videre in situ farmakologisk stimulering av β-cellemasse er et potensielt billig og skalerbar behandlingsstrategi. Heri et høyt innhold screening fremgangsmåte for å identifisere og karakterisere små molekyler som stimulerer β-cellevekst er presentert.

En rekke in vitro eksperimentelle metoder kan anvendes for å identifisere genprodukter og / eller molekyler that fremme primære β-celle replikering. Tidlig innsats for måling av β-celle replikering induksjon brukes fosterets gnager pankreata kultur eller intakte isolert holmen kulturer å måle ^[3H] tymidin inkorporering, BrdU inkorporering eller mitotiske organer innenfor aldehyd-thionin eller insulin farget befolkning som svar på konkrete behandlingsforhold ^{10, 11.} Disse in vitro tilnærminger og nære varianter av disse har flere begrensninger. Prominente mangler inkluderer (1) bruk av føtale celler som, i motsetning til modne p-celler, viser en høy basal β-celle replikering rate og er vekst regulert i en tydelig måte ^12; (2) den subjektive natur eksperimentator avhengig pådømmelse av β-celle replikering hendelser; (3) arbeids- og tidkrevende natur eksperimentator avhengig telling av β-celle replikering hendelser forsinker eksperimentell gjennomstrømming; (4) bruk av kjernefysisk innlemmelse / beis / utseende til å identifisere replikering selvts og en ikke-overlappende cytoplasmisk flekken for å identifisere p-celler fører til misattribution av tilgrensende ikke-β-cellereplikasjonshendelser til p-celler.

Mer nylig modne primære p-celler er blitt anvendt for å vurdere effekten av transgene over-ekspresjon, så vel som genprodukt eller behandling med forbindelsen på β-celle-replikasjon ^13-16. Imidlertid har disse studiene også grunnlag subjektive telling av replikering hendelser, cytoplasmatiske staining- eller ikke-spesifikke metoder for β-celle identifisering og / eller arbeidskrevende tiltak som begrenser gjennomstrømning, f.eks enkelte slide-vel plating av celler eller intakt holme parafin embedding og behandling ^17. Spesielt, en bildebasert human β-celle-replikasjon screening metode, lik den som er presentert heri, er blitt publisert ^18; har imidlertid vellykket bruk av denne analysen ikke blitt demonstrert og bruken av humane øyer for primær screening kan ikke bli så å si fealig.

En alternativ strategi for å identifisere replikasjonsfremmende stoffer er å vurdere veksten induksjon av β-cellelinjer. Innledende forsøk brukes forvandlet betacellelinjer som min6 celler eller INS 832/13-celler ^14,19-21. Men disse cellelinjer demonstrere uhemmet vekst og har liten likhet med godt differensierte p-celler ^22. Følgelig er minimalt, av uklare relevans og noen ganger vanskelig å rekapitulere vekst-induksjon kapasitet. En forbedret strategi for cellelinje basert screening benytter "reversibelt transformerte" celler som er veksten arrestert i fravær av tetracyklin (doksycyklin) -avhengig SV40 T-antigen ekspresjon ^23,24. Imidlertid er det uklart om disse cellene gå tilbake til en "normal" β-celle-lignende tilstand etter doksycyklin fjerning. Dessverre har bruken av disse cellene ga en generell vekstfremmende stoffer som ikke synes å ha umiddelbar nytte24. Samlet bruk av cellelinjene for å studere vekstregulering av en celletype som viser minimal spontan replikasjonsaktivitet kan ha begrenset anvendelighet.

Den β-celle replikering screening plattform som presenteres her benytter modne primære rotte p-celler til å beholde in vivo vekstregulering i den grad det er mulig, holme-cellekulturer med blandet celletype sammensetning for å muliggjøre identifisering av avstamning begrensede vekstfremmende aktiviteter, multi -Vel formatering for å maksimere gjennomstrømningen og automatisert analyse for å eliminere skjevhet og legge til rette for gjennomstrømming. Vellykket bruk av denne plattformen har gjort det mulig identifisering av flere forbindelser som fremmer β-celle replikering ^25,26. I tillegg har analysen vært brukt til struktur-aktivitetsforhold studier og kjemiske epistasis eksperimenter for å tilveiebringe mekanistiske innsikt i den molekylære regulering av β-celle-replikasjon. Den presenterte plattformen ble vellykket tilpasset for lentiviral RNAi-basert undersøkelse av β-celle replikering trasé ^25. Begrensninger av analysen omfatter bundne skalerbarhet (bruk av primærceller), bruk av gnager heller enn menneskelige holmen-celler (selv om analysen kan tilpasses for menneske holmen studier), kostnader forbundet med antistoff-basert bildebehandling og primær holme bruk, bruk av spredte holmer (forstyrret holme arkitektur) for å lette automatisert bilde oppkjøpet og avhengighet av tilgjengeligheten av en automatisert mikroskop med bilde oppkjøpet og analyse evne. Selv om en lettvint in vivo screening-metoder for identifisering av genprodukter eller forbindelser som stimulerer β-celle regenerering in situ ville være ideelt, er en slik plattform ikke ennå er tilgjengelig ^27. Følgelig er hensiktsmessig for forskeren er interessert i å undersøke de fleste aspekter av β-celle replikering den beskrevne plattformen.

Protocol

Denne protokollen ble utført i samsvar med Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC) ved Stanford University School of Medicine. Den beskrevne protokoll er skalert for holme isolert fra seks 250-300 g (8 – 9 uker gamle) Sprague Dawley hannrotter, som er tilstrekkelig til å generere 228 brønner i en 384-brønners plate for islet celle-replikasjon vurdering. 1. Material Forberedelse Forbered belegg media før start holme isolasjon ved å samle det kondisjonerte medium av 804G rotte…

Representative Results

For å vurdere β-celle eller α-celle-replikasjon, er en fire-fargers analyseprotokollen som kreves. Først blir gjenstander identifiseres ved DAPI farging (kanal 1, 386 nm). Deretter blir p-celler (event 1) telles: objekter som co-uttrykke PDX-1 + (kanal 2, 650 nm) og peri-atom insulin (kanal 3, 549 nm). Deretter blir replikere p-celler (hendelses 2) telles: P-celler (event 1) som co-express Ki-67 (kanal 4, 485 nm) (figur 3). Prosentandelen av replikerende p…

Discussion

Eksperimentelle metoder for å studere de molekylære stier som styrer β-cellevekst og regenerering er viktige verktøy for diabetes forskere. Heri, til en rotte-islet-basert screening plattform identifisere og karakterisere små-molekyl stimulatorer for β-celle-replikasjon er presentert.

Mens de fleste aspekter av denne protokollen er lett utføres av erfarne forskere, noen få skritt krever spesiell teknikk. Først i løpet av holmen isolasjon, kanylering av galle-kanal uten å forstyrre…

Materials

250g male Male Sprague Dawly Rat	Charles River	Stain # 400
12 cm teeth tisuue forceps	Fine Science Tools	11021-12
11.5 cm fine scissors	Fine Science Tools	14058-11
14.5 cm surgical scissors	Fine Science Tools	14001-14
16 cm curved forceps	Fine Science Tools	11003-16
12 cm curved hepostat	Fine Science Tools	13011-12
12 cm scalpel handle	Fine Science Tools	10003-12
Tissue sieve-30 mesh	Bellco Glass	1985-85000
Cizyme RI, 375,000 CDA units	VitaCyte	005-1030
Hanks' Balanced Salt solution (Ca++ and Mg++)	Gibco	24020-117
Ketamine HCl (200 mg/20 ml)	JHP Pharmaceuticals	NDC# 42023-113-10	to make anesthetic cocktail
Xylazine (5 g/50 ml)	LLOYD	NADA# 139-236	to make anesthetic cocktail
Histopaque 1077	Sigma	H-1077	to make histopaque 1100
Histopaque 1119	Sigma	H-1119	to make histopaque 1100
Newborn Calf Serum 500 ml	Hyclone	SH30118.03
Hanks' Balanced Salt solution	Hyclone	SH30268.01
Dulbecco's Modified Eagle Medium/Low Glucose	Hyclone	SH30021.01
Functionality/Viability Solution	Mediatech	99-768-CV
RPMI1640 media	Hyclone	SH30096.01	to make conditioned medium
804G rat bladder carcinoma cell-line	Available upon request		to make conditioned medium
Fetal Bovine Serum, Qualified	Gibco	26160
GlutaMax-I	Gibco	35050-061
Penicillin (5,000 IU/ml/Strptomycin (5 mg/ml)	MP Biomedicals	1670049
Formamide 500 mL	Fisher BioReagents	BP227-500
Antigen Unmasking Solution 250 mL (PH 6.0)	Vector Laboratories	H-3300	to make 0.15 M Sodium Sitrate solution
Dextrose, Anhydrous	EMD Chemicals	DX0145-1	to make 1 M glucose solution
Nomal Donkey Serum (Powder)	Jackson ImmunoResearch	017-000-121
Triton X-100	Sigma	T8787-100ML
Mouse anti-human Ki67 antibody	BD Biosciences	556003
Goat anti-human PDX-1 antibody	R&D Systems	AF2419
Polyclonal Guinea Pig anti-insulin antibody	Dako	2016-08
Polyclonal Rabbit anti-glucagon antibody	Dako	2014-06
Polyclonal Rabbit anti-somatostatin antibody	Dako	2011-08
Polyclonal chicken anti-vimentin antibody	abcam	ab24525
Biotin-SP-conjugated, Donkey Anti-Mouse IgG	Jackson ImmunoResearch	715-065-150
StreptAvidin, Alex Flour 488 conjugated	Invitrogen	S32354
Rhodamine-conjugated Donkey Anti-Goat IgG	Jackson ImmunoResearch	705-025-147
Rhodamine-conjugated Donkey Anti-Guinea Pig IgG	Jackson ImmunoResearch	706-025-148
Rhodamine-conjugated Donkey Anti-Rabbit IgG	Jackson ImmunoResearch	711-025-152
Cy 5-conjugated Donkey Anti-Guinea Pig IgG	Jackson ImmunoResearch	706-175-148
Cy 5-conjugated Donkey Anti-Goat IgG	Jackson ImmunoResearch	705-175-147
Cy 5-conjugated Donkey Anti-Rabbit IgG	Jackson ImmunoResearch	711-175-152
Cy 5-conjugated Donkey Anti-Chicken IgG	Jackson ImmunoResearch	703-175-155
DAPI	Millipore	S7113
Disposable Reagent Reservoir 25 mL	Sorenson BioScience	39900
384 well, black/clear, tissue culture treated plate	BD Falcon	353962
96 well, black/clear, tissue culture treated plate	Costar	3603
Multi-channel pipettor	Costar	4880
12-channel vaccume aspirator	Drummond	3-000-096
Cell Scraper	Falcon	353085
Isotemp Water Bath Model 2223	Fisher Scientific
High-content screening instrument: ArrayScan VTI	Thermo Scientific