이 수정 추출 프로토콜은 조직 병리학 적 조직 블록에 대한 관심이 더 정확하게 대상 지역의 RNA 및 DNA 수율을 향상시킨다.
Formalin-fixed paraffin embedded tissue (FFPET) represents a valuable, well-annotated substrate for molecular investigations. The utility of FFPET in molecular analysis is complicated both by heterogeneous tissue composition and low yields when extracting nucleic acids. A literature search revealed a paucity of protocols addressing these issues, and none that showed a validated method for simultaneous extraction of RNA and DNA from regions of interest in FFPET. This method addresses both issues. Tissue specificity was achieved by mapping cancer areas of interest on microscope slides and transferring annotations onto FFPET blocks. Tissue cores were harvested from areas of interest using 0.6 mm microarray punches. Nucleic acid extraction was performed using a commercial FFPET extraction system, with modifications to homogenization, deparaffinization, and Proteinase K digestion steps to improve tissue digestion and increase nucleic acid yields. The modified protocol yields sufficient quantity and quality of nucleic acids for use in a number of downstream analyses, including a multi-analyte gene expression platform, as well as reverse transcriptase coupled real time PCR analysis of mRNA expression, and methylation-specific PCR (MSP) analysis of DNA methylation.
유전체 바이오 마커 연구는 정확하고 신뢰성 질병 상태를 반영하고, 임상 적으로 유용한 방식으로 그렇게. 한 바이오 마커의 개발은 잘 주석 조직 샘플의 후 향적 분석에 의존 분자 상관 관계를 파악하고자한다. 질병과 정상 조직 샘플은 신선한 냉동 조직 전문 바이오 뱅크 또는 임상 아카이브에서 포르말린 고정 파라핀 조직 (FFPET) 블록으로 하나 저장됩니다. 신선한 냉동 조직 고품질 핵산의 추출을 허용 널리 게놈 바이오 마커 발견 연구에 사용되었다. 2,3- 다소 적은 조직 샘플은 바이오 뱅크에 사용할 수 있으며, 이러한 조직을 연구하는 것은 큰 샘플 특이 카테고리 향해 바이어스를 소개 뱅크 조직에 큰 능력을 가진 전문 센터에서 보이는 질환의 환자. 4 FFPET 대조적 질환 인간 및 동물 조직의 기본 저장 방법이다. FFPET 블록 셀룰러 m을 유지하면서orphology, 정착 프로세스 가교 핵산이 다른 세포 성분. 가교 RNA 및 DNA 복구 할 수 있습니다,하지만 성능 저하, 높은 조각난 형태. 5,6 그러나, 이러한 DNA 및 RNA 조각은 mRNA 발현, DNA 메틸화 및 타겟 시퀀싱을 포함하여 분석의 확장 배열에 의해 분석 의무가 있습니다. 7,8-가 다량 연구 가능한 FFPET의 다양한 기회를 이용하기 위해 효율적이고 신뢰성있는 추출 프로토콜에 대한 필요성이 존재한다.
조직에서 바이오 마커 연구의 큰 비율은 암에 초점을 맞추고 있습니다. 병에 걸린 조직의 다른 유형과 마찬가지로, 암 조직은 종종 세포의 보존과 세포 유형에서 중요한 지역 이질성을 보여줍니다. 바이오 마커 연구 분자 기능 환부 조직의 구성 요소의 상관 관계를 할 수있는 능력에 의존하기 때문에,이 프로세스의 중요한 단계는 잘 보존 D 및 충실 조직의 정확한 수확이다연구 대상 isease. FFPET에서,이 농축 기술이 자주 이용된다 : 레이저 캡처 미세 절제 (LCM) 및 마이크로톰 절편. LCM은 높은 조직 채취 집중 가능 이종 조직에서 특이 잘 보존 된 세포 유형을 분리 할 수있다. 9,10 그러나 LCM 샘플 다수 위해 소모 엄청나게 시간 고가의 장비를 필요로하고있다. 마이크로톰 단면이 얇은 섹션 FFPET 블록에서 절단보다 널리 사용되는 방법이다. (11, 12) 마이크로톰 컷 부분은 종종 세포의 보존에 이기종입니다 조직을 포함한다 (예를 들어, 괴사 대 잘 보존)와 구성 (예를 들어, 암 대 따라서 양성 실질)과는 별도로 조사 최선의 분자 기능의 균질화가 발생할 수 있습니다. 따라서, 관심있는 세포가 풍부 고 처리량 방법이 요구된다. 세 번째 방법, FFPET 코어로부터 핵산의 분리는이 농축을 제공 높은 통해 서 적합프로토콜 hput, 분리 조직 코어로부터 RNA 또는 DNA를 분리하는 다른 사람에 의해 이용되고있다. 7,13,14
게시 된 프로토콜의 숫자는 FFPET (표 1)에서 핵산을 추출하는 방법을 지정합니다. 그러나, RNA 및 DNA가 같은 조직으로부터 추출 된 프로토콜이 아닌 조직 코어를 들면, 마이크로톰 조직 섹션에 최적화되어있다. 조직 특이성을 증가 제공 (15, 16) 마찬가지로, 출판 프로토콜을 하나의 조직 코어 또는 슬라이드 microdissections를 통해 절차를 지정 DNA의 추출,하지만 여기되지 RNA. 7,17, 같은 조직 코어에서 모두 DNA와 RNA의 이중 추출을위한 최적화 된 프로토콜에 대한 설명된다. 조직 코어는 FFPET 블록에 매핑 관심의 영역으로 조직 마이크로 어레이 (TMA) 펀치를 삽입하여 수확. 매핑은 마커 펜 현미경 슬라이드에 주석 및 대응 FFPE의 표면에 주석을 전사함으로써 수행T 블록 (그림 1).
이 프로토콜의 개발을 주도 이전 작업은 몇몇 시판의 핵산 추출 시스템의 비교를 포함. 이 비교에서, 상업적 프로토콜 변형은 후술하는 바와 같이 높은 DNA 및 RNA 수율 및 품질 (Selvarajah 외., 준비하여) 제공 하였다. 조직 코어는 전형적 FFPET 추출 11,12,14,18 프로토콜에서 사용되는 5-10 μm의 미크론 부보다 두꺼운 – 20 파라핀보다 다양한 양을 함유 할 수있다. 이를 보상하기 위해, 탈 파라핀 크실렌, 에탄올 치료를 반복하여 동력 균질화 공정 (도 1)을 도입함으로써 확장되었다. 또한, 단백질 분해 효소 K 분해 시간은 DNA 수율을 높이기 위해 연장되었다. 전반적으로,이 프로토콜은 비용 효과적이고 라 질병의 분자 병리 조직 학적 기능 사이의 결합의 설립을 가능하게RGE 잘 특성화 인구. 전체의 프로토콜은 전문 또는 고가의 장비에 대한 약간의 필요에 손에 시간이 3 시간을 포함하여 2 일 이내에 안정적으로 수행 할 수있다.
단계별 프로토콜은 제조 업체의 프로토콜의 수정 된 버전으로 이하이다. (21)는 특정 시약, 장비 및 제조 업체에 대한 자재 / 장비의 표를 참조하십시오.
관심의 조직 영역에서 DNA 및 RNA를 성공적으로 추출, 정확한 코어 링이 중요합니다. 이 프로토콜은 0.6 mm 직경의 코어를 분리하는 조직 펀치의 사용을 설명하고 현미경 표기를 전송하는 과정 FFPET 블록에 대응하는 슬라이드를 설명. 제조 업체의 프로토콜에 대한 수정을 효율적으로 약 프로토콜이 의도 된 마이크로톰 섹션보다 50 배 두꺼운 코어에서 핵산을 추출해야했습니다. 코어가 조직 섹션에 더 파라핀 왁스의 상대, 반복 자일 렌, 에탄올 처리 단계를 통해 코어의 효과적인 탈 파라핀을 포함 할 수 있기 때문에 필요했다. 탈 파라핀 후의 단계의 성공은 적절한 기계적 조직 코어 균질화 효율적인 테 K 소화에 의존. 프로 테이나 제 K 소화의 추가 최적화가 수행 될 수있다.
그것은 언급 할 가치가 그이 방법의 식별자병리 조직 슬라이드를 대응에 식별 된 블록의 표면에 관심 아 보라 영역. 3 4mm 깊이 될 수있는 핵심 수확 조직으로,이 프로토콜의 사용자는 세포 또는 조직이 블록의 표면 아래에 누워 무엇에 대해 우려 할 수있다. 이것이 유효한 문제이지만, (참고 27에서 검토) 여러 연구 조직 코어 충실히 중복 또는 삼중 코어가 관심의 영역으로부터 샘플링 특히, 병리 조직 블록의 조직 학적 및 분자 특성을 나타낸다는 것을 증명 하였다.
이 프로토콜에 채용 개질 상용 추출 키트는 동일한 조직에서 모두 DNA 및 RNA의 동시 추출을 가능하게 된 바와 같이, 프로토콜은 귀중한 생체 물질을 저장하고, 동일한 샘플에서 두 얻어진 핵산 사이의 직접적인 비교를 허용한다. RNA 및 DNA의 동시 추출은 반으로 노동과 조직 파괴를 줄인다, 유전자 EXPR의 정확한 통합 분석이 가능ession뿐만 아니라 DNA에서 발견 후생 유전 학적 및 유전 적 특징. 이러한 대표적인 조직 코어에서 모두 RNA와 DNA의 수율을하기 때문에 일반적으로 각각 600, 300 NG를 초과하고, 가장 최근의 PCR 차세대 시퀀싱 애플리케이션은 일반적으로 10-100 NG가 필요하기 때문에,이 프로토콜에 의해 정제 된 샘플의 대부분은 충분히 제공해야 여러 개의 다운 스트림 분석에 대한 자료. 이 프로토콜은 독립적 인 실험실에 걸쳐 재현 가능한 것으로 밝혀졌다 (Selvarajah 외., 준비한다.). 이 프로토콜에서 RNA를 RT-PCR 또는 인기 다중 동시 플랫폼을 사용하는 유전자 발현 분석을위한 충분한 품질이고, DNA 메틸화는 특정 PCR 분석에서 잘 수행 하였다. 차세대 시퀀싱에 복구 된 핵산의 유용성을 평가하기위한 미래 연구가 보증됩니다.
따라서, 여러 변형이 FO 적합한를 렌더링 얇은 FFPET 부 설계된 시판 프로토콜을 만들었다0.6 mm의 FFPET 코어에서 RNA 및 DNA의 연구 공동 추출. 프로토콜은 전립선 암 샘플의 큰 집단 및 유방, 뇌 및 방광의 암에서 샘플의 제한된 세트에 지속적으로 높은 수율을 보였다. 전반적으로, 프로토콜은 큰 잘 주석이 조직 컬렉션의 대상으로 유전자 기반의 분석을 수행 할 수 있도록해야합니다. 중요한 것은, 프로토콜은 대부분의 다운 스트림 응용 프로그램에 대한 FFPET에 대한 관심의 영역을 효율적으로 집중 샘플링, 상대적으로 작은 손에 시간, 충분히 높은 수율을 가능하게한다.
The authors have nothing to disclose.
This research was supported by a team grant from Movember/Prostate Cancer Canada to JMSB, DMB, PCP, and JL, and by the Ontario Institute of Cancer Research (JMSB, DMB, and PCP) and Motorcycle Ride for Dad Kingston/University Hospitals Kingston Foundation/Kingston General Hospital (DMB, PCP).
Plastic paraffin film, "Parafilm 'M'" | Bemis | RK-06720-40 | Any generic paraffin film will work as a substitute |
Sodium Hypochlorite, "Ultra Bleach" | Likewise | 53-2879-2 | Any generic bleach will work as a substitute. Hazardous material that can cause burns on contact. |
Molecular biology grade absolute ethanol | Fisher BioReagents | BP2818-500 | Sigma-Aldrich E7023 suffices as a substitute |
Molecular Grade H2O | G-Biosciences | 786-293 | Sigma W4502 suffices, as well as any other brand of molecular grade H2O |
0.6mm Punch Set for Beecher Instruments | Estigen | MPO6[Yellow] | Make sure to use the red receiver punch from the set |
Fine point permanent marker | Sharpie | 10365796S | Using the marker on FFPE tissues causes it to dry out quickly, so several may be required |
FFPE tissue block | |||
Stained tissue slide corresponding to FFPE block | |||
1.5 mL Micro-Centrifuge Tubes | Fisher BioReagents | 05-408-137 | |
2.0 mL Low binding tubes (LoBind Micro-Centrifuge Tubes) | Eppendorf | 22431048 | |
1.5 mL Low binding tubes (LoBind Micro-Centrifuge Tubes) | Eppendorf | 22431021 | |
Histology Xylene | VWR | CA 95057-822 | Fisher Scientific X5-500 suffices as a substitute |
Molecular Biology Grade 2-Propanol | Sigma | I9516 | |
AllPrep FFPE DNA/RNA Kit | Qiagen | 80234 | Prepare buffers accodring to the AllPrep DNA/RNA FFPE Handbook21 |
Buffers: RLT, FRN, RPE, ATL, AL, AW1, AW2, DNaseI solution | Qiagen | 80234 | Prepare buffers accodring to the AllPrep DNA/RNA FFPE Handbook21 |
Temperature stable proteinase K | Qiagen | 80234 | |
High potency proteinase K | Invitrogen | 25530-049 | Invitrogen 25530-015 suffices as a substitute |
RNAse neutralizing solution (Rnase AWAY) | Molecular BioProducts | 7003 | |
RNaseA 100mg/mL | Qiagen | 19101 | |
BD Integra Syringe 3mL 21G x 1/2 | BD | 305274 | |
Motorized tissue homogenizer (TissueRuptor) | Qiagen | 9001271 | Fisher Scientific 14-261-29 suffices as a substitute |
-20°C and -80°C Laboratory Freezer | |||
Micro-Centrifuge with rotor for 2mL tubes | |||
Digital Vortex Mixer | |||
Pipettes and filter tips | |||
Heating blocks or water baths | |||
Tris Hydrochloride | Amresco | 0234 | |
Sodium Chloride | Amresco | 0241 | |
Anhydrous Magnesium Chloride | Sigma | M8266 | |
Sodium Dodecyl Sulfate | Sigma | L4509 | |
Acrodisc 25mm syring filters with 0.45 um Supor membrane | Pall | PN 4614 | |
Syringe with retracting BD PrecisionGlide needle 3mL | BD Integra | 305274 | |
Hydrochloric Acid | BDH | 3026 | |
Multianalyte gene expression platfrom (nCounter ® CAE codeset and Nanostring nCounter platform) | Nanostring nCounter platform, Nanostring | ||
Fluorometric nucleic acid quantification (Qubit dsDNA HS Assay Kit and Qubit® RNA BR Assay Kit) | Invitrogen |