En robot plattform for High-throughput Protoplast Isolering og Transformation

Summary

En høy gjennomstrømming, automatisert, tobakk protoplast produksjon og transformasjon metodikk er beskrevet. Den robotsystem gjør massivt parallell genekspresjon og funn i modellen BY-2 system som skal være oversettes til ikke-modellen avlinger.

Abstract

I løpet av det siste tiåret har det vært en oppblomstring i bruk av planteprotoplaster som spenner fra modellarter for å beskjære arter, for analyse av signaloverføringsveier, transkripsjonsregulerende nettverk, genekspresjon, genom-redigering, og gene-demping. Videre har betydelige fremskritt er gjort i regenerering av planter fra protoplaster, som har generert enda mer interesse i bruken av disse systemene for plantegenomforskning. I dette arbeidet har en protokoll utviklet for automatisering av protoplast isolasjon og transformasjon fra en "Bright Yellow '2 (BY-2) tobakk suspensjonskultur ved hjelp av en robot plattform. De transformasjonsprosedyrer ble validert ved bruk av et oransje fluorescerende protein (OFP) reporter-gen (pporRFP) under kontroll av blomkål mosaikkvirus 35S-promotoren (35S). OFP uttrykk i protoplaster ble bekreftet av epifluorescence mikroskopi. Analyser også inkludert protoplast produksjon effektivitet metoder ved hjelp propidium jod. Til slutt ble lavkost mat-grade enzymer brukes til protoplasten isoleringsprosedyren, omgå behovet for laboratorie vurder enzymer som er kostnads ​​uoverkommelige i high-throughput automatisert protoplast isolasjon og analyse. Basert på den protokoll som er utviklet i dette arbeidet, kan hele prosedyren fra protoplast isolasjon til transformasjon utføres i henhold til 4 timer, uten noen inndata fra operatør. Mens protokoll utviklet i dette arbeidet ble validert med BY-2 cellekultur, bør de prosedyrer og metoder være settes til alle anlegg suspensjon kultur / protoplast system, som skal gjøre det mulig akselerasjon av avlingsgenomforskning.

Introduction

I de senere årene har det vært en betydelig drivkraft plassert på utformingen av transgene avlinger til å overvinne ulike sykdommer ^1, gi gave til ugressmiddel motstand ^2, jf tørke ^3,4 og salttoleranse ^5, forhindre herbivory ^6, øke biomassen utbyttet ^7, og redusere celleveggen recalcitrance ^8. Denne trenden har blitt hjulpet av utviklingen av nye molekylære verktøy for generering av transgene planter, inkludert genom-redigering med CRISPR og Talens ^9, og genet stanse gjennom dsRNA ^10, miRNA ^11, og siRNA ^12. Selv om disse teknologiene har forenklet generering av transgene planter, har de også opprettet en flaskehals, der det store antallet av transgene planter som genereres kan ikke bli vist ved hjelp av tradisjonelle systemer som er avhengige av plante regenerering. Relatert til dette flaskehalsen, mens tie og genom-redigering konstruksjoner kan raskt settes inn planter, mange avmålrettede egenskaper mislykkes i å gi den ønskede effekten, som ofte ikke oppdages før plantene er analysert i drivhuset. I dette arbeidet har vi utviklet en metode for rask, automatisert, high-throughput screening av planteprotoplaster, spesielt for å møte den nåværende flaskehals tidlig screening av et stort antall genom-redigering og genet Slå mål.

Bruken av protoplaster, i motsetning til intakte planteceller, har flere fordeler for utvikling av en automatisert plattform. Først blir protoplaster isoleres etter oppslutning av plantecelleveggen, og med denne barrieren ikke lenger er til stede, er transformasjonseffektiviteten økes ^13. I intakte planteceller er det bare to godt etablerte metoder for transformasjon, biolistics ¹⁴ og Agrobacterium-formidlet transformasjon ^15. Ingen av disse metodene kan lett oversettes til væskehåndtering plattformer, som biolistics krever spesialisert utstyr for transformation, mens Agrobacterium-formidlet transformasjon krever ko-kultur og etterfølgende fjerning av bakteriene. Verken er mottagelig for høy gjennomstrømning metoder. I tilfelle av protoplaster, blir transformasjonen rutinemessig utført ved bruk av polyetylenglykol (PEG) -mediert transfeksjon ^16, som bare krever flere løsnings utveksling, og er ideelt egnet for væskehåndtering plattformer. For det andre protoplaster, ved definisjon, er enkelt-cellekulturer, og dermed de problemer som er forbundet med klumpdannelse og kjededannelse i plantecellekulturer, ikke blir observert i protoplaster. I form av rask screening ved hjelp av en plate-baserte spektrofotometer, klumper av celler eller celler i flere plan vil føre til vanskeligheter med å skaffe konsistente målinger. Siden protoplaster er også tettere enn deres kulturmedia, de sedimentere til bunnen av brønner, å danne et monolag, som er rette for platebasert spektrofotometri. Til slutt, mens plantecellesuspensjonskulturer er Primarily avledet fra callus ^17, kan protoplaster høstes fra en rekke plantemateriale, som fører til evnen til å identifisere vev-spesifikk ekspresjon. For eksempel, evnen til å analysere rot-eller blad-spesifikk ekspresjon av et gen som kan være svært viktig for fenotype forutsigelse. Av disse grunner ble protokollene utviklet i dette arbeidet validert ved bruk av protoplaster isolert fra den mye brukte tobakk (Nicotiana tabacum L.) «Bright Yellow '2 (PR-2) suspensjonskultur.

Den BY-2 suspensjonskultur er blitt beskrevet som "HeLa" celle fra høyere planter, på grunn av dens utbredte anvendelse ved molekylær analyse av planteceller ^18. Nylig, AV-2 celler har blitt brukt til å studere effekter av stressfaktorer ^19-22, intracellulær protein lokalisering ^23,24, og grunnleggende cellebiologi ^25-27 demonstrere bred nytten av disse kulturene i plantebiologi. En ekstra fordel av PR-2 kulturer erevne til å synkronisere kulturene med aphidicholin, noe som kan føre til forbedret reproduserbarhet for genuttrykkstudier ^28. Videre fremgangsmåter er blitt utviklet for utvinning av PR-2-protoplaster ved hjelp av rimelige enzymer ^29,30, som enzymer som tradisjonelt brukes for generering av protoplaster er kostnads prohibitive for high-throughput-systemer. Som sådan har den protokoll som er beskrevet nedenfor blitt validert ved hjelp av PR-2 suspensjonskultur, men det bør være amendable til en hvilken som helst plante cellesuspensjonskultur. Proof-of-concept eksperimenter er utført ved hjelp av et oransje fluorescens protein (OFP) reporter-gen (pporRFP) fra den harde koraller Porites porites ³¹ under kontroll av CaMV 35S-promotoren.

Protocol

1. Etablering av Suspension cellekulturer Fremstille flytende BY-2-medier ved tilsetning av 4,43 g Linsmaier & Skoog Basal Media, 30 g sukrose, 200 mg KH 2PO 4, og 200 ug av 2,4-diklorfenoksyeddiksyre (2,4-D) til 900 ml destillert vann og pH-verdien til 5,8 med 0,1 M KOH. Etter justering av pH-verdien, justere sluttvolumet til 1000 ml med destillert vann og autoklav. Media kan lagres opp til 2 uker ved 4 ° C. Inokulere en 250 ml Erlenmeyer-kolbe med 100 ml flytende PR-2-me…

Representative Results

I denne studien, doblings frekvensen av PR-2 varierte 14-18 timer avhengig av temperaturen ved hvilken kulturene ble inkubert, i samsvar med tidligere rapporter om en midlere cellesykluslengde av 15 timer. Med denne dobling hastighet, en 1: Det ble 100 starter inokulum anvendt for å initiere kulturer, noe som fører til kulturene med en pakket cellevolum (PCV) av 50% i 5-7 dager. I den nåværende protokoll, i hvilket kulturer ble dyrket i 200 ml medium, ble en hematokrit på 100 ml ble…

Discussion

Protokollen er beskrevet ovenfor har blitt validert for protoplasten isolasjon, telling, og transformasjon ved hjelp av PR-2 tobakksuspensjonscellekultur; imidlertid protokollen kan lett utvides til en hvilken som helst plante suspensjonskultur. I dag har protoplast isolasjon og transformasjon er oppnådd i mange planter, inkludert mais (Zea mays) ^10, gulrot (Daucus carota) ^32, poppel (Populus Euphratica) ^33, drue (Vitis vinifera) ^34, oljepa…

Materials

Orbitor RS Microplate mover	Thermo Scientific
Bravo Liquid Handler	Agilent
Synergy H1 Multi-mode Reader	BioTek
MultiFlo FX Multi-mode Dispenser	BioTek
Teleshake	Inheco	3800048
CPAC Ultraflat Heater/cooler	Inheco	7000190
Vworks Automation Software	Agilent		Software used to control and write protocols for Agilent Bravo
Momentum Software	Thermo Scientific		Task scheduling software for controlling Orbiter RS
Liquid Handling Control 2.17 Software	Biotek		Software used to control and write protocols for MultiFlo FX
IX81 Inverted Microscope	Olympus
Zyla 3-Tap microscope camera	Andor
ET-CY3/TRITC Filter Set	Chroma Technology Corp	49004
Rohament CL	AB Enzymes	sample bottle	low-cost cellulase
Rohapect UF	AB Enzymes	sample bottle	low-cost pectinase
Rohapect 10L	AB Enzymes	sample bottle	low-cost pectinase/arabinase
Linsmaier & Skoog Basal Medium	Phytotechnology Laboratories	L689
2,4 dichlorophenoxyacetic acid	Phytotechnology Laboratories	D295
propidium iodide	Sigma Aldrich	P4170
Poly (ethylene glycol) 4000	Sigma Aldrich	95904-250G-F	Formerly Fluka PEG
Propidium Iodide	Fisher Scientific	25535-16-4	Acros Organics
CaCl2	Sigma Aldrich	C7902-1KG
Sodium Acetate	Fisher Scientific	BP333-500
Mannitol	Sigma Aldrich	M1902-1KG
Sucrose	Fisher Scientific	S5-3
KH2PO4	Fisher Scientific	AC424205000
KOH	Sigma Aldrich	P1767
Gelzan CM	Sigma Aldrich	G1910-250G
6-well plate	Thermo Scientific	103184
96-well 1.2 ml deep well plate	Thermo Scientific	AB-0564
96 well optical bottom plate	Thermo Scientific	165305
Finntip 1000 Wide bore Pipet tips	Thermo Scientific	9405 163
NaCl	Fisher Scientific	BP358-10
KCl	Sigma Aldrich	P4504-1KG
MES	Fisher Scientific	AC17259-5000
MgCl2	Fisher Scientific	M33-500