Kirurgisk Approach for mellem-cerebral arterieokklusion og reperfusion induceret Stroke i mus

Summary

For at forstå patofysiologien af ​​slagtilfælde, er det vigtigt at anvende pålidelige modeller. Dette dokument vil beskrive en af ​​de mest hyppigt anvendte slagtilfælde modeller i mus, betegnet den midterste cerebrale arterie (MCAO) model (også betegnet den intraluminale fibres sutur model) med reperfusion.

Abstract

Slagtilfælde er en førende dødsårsag i verden og fortsætter med at være en af ​​de hyppigste årsager til langsigtede voksne handicap. Omkring 87% af slagtilfælde er iskæmisk oprindelse og forekommer i det område af den midterste cerebrale arterie (MCA). I øjeblikket er den eneste Food and Drug Administration (FDA) godkendte lægemiddel til behandling af denne ødelæggende sygdom er vævsplasminogenaktivator (TPA). Imidlertid tPA har en lille terapeutisk vindue til indgivelse (3 – 6 timer), og er kun effektiv i 4% af de patienter, der rent faktisk modtager den. Nuværende forskning fokuserer på forståelse af patofysiologien af ​​slagtilfælde for at finde potentielle terapeutiske mål. Således pålidelige modeller er afgørende, og MCA okklusion (MCAo) model (også kaldet den intraluminale fibres sutur model) anses for at være den mest klinisk relevante kirurgiske model for iskæmisk slagtilfælde, og er temmelig ikke-invasiv og let reproducerbare. Typisk MCAo modellen anvendes med gnavere, især med mus på grundtil alle de genetiske variationer rådighed for denne art. Her beskriver vi (og til stede i videoen) hvordan man med held udføre MCAo model (med reperfusion) i mus til at generere pålidelige og reproducerbare data.

Introduction

Slagtilfælde er den femte førende dødsårsag på verdensplan, med én person dør af sygdommen hvert 4. minut. Over 800.000 amerikanere lider et slagtilfælde hvert år, som ikke alene ødelæggende for patienten, men også for deres familier. Slagtilfælde er den vigtigste årsag til voksen handicap og de årlige udgifter anslås at være i størrelsesordenen milliarder $ 36,5 ¹ trods meget få behandlingsmuligheder bliver tilgængelige.

Vævsplasminogenaktivator (tPA) er den eneste Food and Drug Administration (FDA) licenseret lægemiddel til iskæmisk slagtilfælde. Det er imidlertid kun effektiv, hvis det gives til patienter inden for 3-6 timer fra indtræden af slagtilfældet, og i disse tilfælde den gavner kun 4% af patienterne ^2. Derfor er det bydende nødvendigt, at reproducerbare, klinisk relevante dyremodeller for slagtilfælde anvendes til at hjælpe med udviklingen af ​​potentielle terapeutiske strategier og behandlinger for denne sygdom. Det er vigtigt at bemærke, at in vitro </em> modeller, mens nyttige i modellering visse aspekter af cerebral dysfunktion, er ikke i stand den gentog de komplekse fysiologiske samspil, der opstår i hjernen og periferien efter et slagtilfælde. Følgelig in vivo modeller er afgørende.

Den mest almindelige form for slagtilfælde er iskæmisk oprindelse, der tegner sig for 87% af de samlede slagtilfælde. Andre slagtilfælde er intracerebral blødning (9%) og subarachnoid blødning (4%), og skyldes mest, ved en emboli til arteria cerebri media (MCA). Dette kan tilskrives den fremtrædende kurve ved roden af ​​MCA, som forårsager laminar blodgennemstrømning ind i hjernen til at blive forstyrret. MCA skyldes den interne halspulsåren (ICA) og ruter langs sidelinjen sulcus, hvor det filialer og projekter til basalganglierne og de laterale overflader af frontal, parietal og tindingelapperne, herunder den primære motor og sensoriske cortex. The Circle of Willis er skabt af posteriore cerebrale arterier bliverforbundet til de cerebrale arterier og de posteriore kommunikerer arterier.

Den intraluminale fibres sutur model af MCAo er en af ​​de mest udbredte i slagtilfælde forskning. Der er dog et par forskellige variationer af denne model, og disse er baseret på, hvorvidt microfilament indsættes i den ydre carotidarterie (ECA, betegnet Longa metode) ^3, eller om den er indsat i ICA (betegnet Koizumi metode) ^4. I Koizumi metode, skal den fælles halspulsåren (CCA) på siden af operationen være permanent bundet, hvis glødetråden er fjernet for at forhindre blødning fra snit i CCA, mens der i Longa metode er Revisionsretten, der skal være permanent bundet ⁵ . Her Longa metode vil blive anvendt som vi mener, dette er en langt overlegen og en mere klinisk relevant kirurgisk model af iskæmisk slagtilfælde. Endvidere er anvendelsen af ​​en silicium-tipped monofilament, især med Longa metode, frembringer megetreproducerbar MCAo i modsætning til de flammehæmmende stump monofilamenter, som ofte frembringer ufuldstændig okklusion og / eller subarachnoid blødning ^6.

Den intraluminale metode filament kan anvendes som en model af permanent eller forbigående okklusion ^4,6. For at udføre den transiente model er filamentet fjernes efter en periode med iskæmi (fx 30 min, 60 min, eller 2 timer), og reperfusion lades ske. Denne model, til en vis grad, simulerer genoprettelse af blodstrømmen efter spontan eller terapeutisk indgreb (f.eks tPA administration) at lysere en tromboembolisk blodprop i mennesker. For permanent model, er den endeløse simpelthen siddende i en periode (fx 24 timer), så ingen reperfusion forekommer. En anden fordel ved den intraluminale filament metoden er, at en kraniotomi ikke behøver at blive udført, så kraniet skal efterlades intakt og undgå eventuelle ændringer i det intrakranielle tryk og temperatur.

<p class = "jove_content"> I denne video viser vi, hvordan du udfører den intraluminale filament metoden Longa at fremkalde MCAo og reperfusion. Vi viser også, hvordan du udfører den 18-punkts neurologiske score og bestemme infarkt lydstyrke med 2,3,5-triphenyltetrazalium chlorid (TTC) farvning.

Protocol

Denne protokol og eksperimenterne rapporteret i videoen blev godkendt af LSUHSC-S Institutional Animal Care og brug Udvalg og er i overensstemmelse med retningslinjerne fra NIH. BEMÆRK: C57BL / 6 mus, der vejede 25 – 29 g blev anvendt i denne undersøgelse. Musene blev holdt på en standard chow pellet diæt med fri adgang til vand, under en 12 timers lys / mørke-cyklus i individuelt ventilerede bure. Proceduren vil blive udført under sterile betingelser under anvendelse af sterile teknikker (f.eks, sterile handsker, ste…

Representative Results

Mus undergik 30-min MCAo-induceret hjerneiskæmi (figur 1) efterfulgt af en periode med reperfusion (24 timer og 1 uge præsenteres her, men længden af reperfusion kan varieres). Dødeligheden under MCAo var minimal (ca. 2%). Indlæg iskæmi, dødeligheden (indenfor de første 24 timer) var omkring 26%. Laser Doppler flowmetri blev anvendt til at bekræfte blodgennemstrømningen perfusion i MCA område før o…

Discussion

Siden dens undfangelse 20 år siden, har MCAo model for human slagtilfælde involverer indsættelse af et filament blevet anvendt i et stort antal undersøgelser. Dette skyldes primært det faktum, at det efterligner det, der sker klinisk i den mest almindelige form for slagtilfælde (dvs. iskæmisk slagtilfælde). Striatum er mere følsomme over for iskæmi end hjernebarken, og som sådan, vil længden af ​​iskæmisk tid oversætte til, om både striatum og dorsolaterale cortex vil blive påvirket, eller b…

Materials

Male C57BL/6 mice	Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME	#000664
Ketamine Hydrochloride	Morris & Dickson, Shreveport, LA	67457-108-10
Xylazine	Akorn, Inc, Lake Forest, IL	NADA# 139-236
DC temperature control system	FHC, Bowdoin, ME	40-90-8D
Mini rectal thermistor probe	FHC, Bowdoin, ME	40-80-5D-02
Heating pad	FHC, Bowdoin, ME	40-90-2-06
Clippers	Amazon, Bellevue, WA	#64800
70% ethanol	Worldwide Medical Products, Bristol, PA	#51011023
Dissecting microscope	Olympus, Center Valley, PA	SZ40
Iris scissors (straight)	Fine Science Tools, Foster City, CA	11251-20
Dumont forceps (45° bent tip)	Fine Science Tools, Foster City, CA	11297-00
Micro vessel clip	Fine Science Tools, Foster City, CA	18055-05
Micro dissecting spring scissors (straight)	Fine Science Tools, Foster City, CA	14088-10
Retractors (blunt)	Fine Science Tools, Foster City, CA	18200-11 (Helen used 17022-13)
Cotton tipped applicators	Fisher Scientific, Waltham, MA	23-400-100
Gauze sponges	Covidien, Mansfield, MA	#9023
6-0 silk braided surgical suture	Roboz, Gaithersburg, MD	SUT-1073-11
0.9% sodium chloride	Morris & Dickson, Lake Forest, IL	0409-4888-20
6-0 medium MCAO suture (silicon rubber coated monofilament)	Doccol Corporation, Sharon, MA	6023PKRe
Sofsilk 6-0 silicone coated braided silk	Covidien, Mansfield, MA	SUT-14-1
Carprofen	Pfizer, New York, NY	NADA# 141-199
Puralube	Dechra, Norwich, UK	NDC 17033-211-38
Physitemp temperature controller	Harvard Apparatus, Holliston, MA	TCAT-2AC
Heat lamp	Harvard Apparatus, Holliston, MA	HL-1
Laser doppler probe	AD Instruments, Colorado Springs, CO	MSP100XP
24-well plates	Fisher Scientific, Waltham, MA	#353226
Phosphate buffered saline (PBS)	Life Technologies, Carlsbad, CA	20012-050
Single edge razor blades	Fisher Scientific, Waltham, MA	12-640
2,3,5-triphenyltetrazalium chloride (TTC)	Sigma Aldrich, St. Louis, MO	T8877-50G
Mouse brain matrix slicer	Braintree Scientific, Braintree, MA	BS-A 5000C
Water bath	VWR, Radnor, PA	#182
10% formalin	Sigma Aldrich, St. Louis, MO	HT501128-4L
Image J analysis software	NIH, Bethesda, MD	free download
Retractor	Medical Device Purchase, Newcastle, CA	MP-740