Nous décrivons un protocole de base pour quantifier l’activité in vitro de l’ATPase. Ce protocole peut être optimisé en fonction du niveau d’activité et des exigences d’une ATPase purifiée donnée.
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Dans cet article
Résumé
Résumé
enzymes triphosphate-hydrolyser adénosine, ou ATPases, jouent un rôle essentiel dans un large éventail de fonctions cellulaires. Ces protéines dynamiques peuvent générer de l'énergie pour le travail mécanique, comme le trafic de protéines et la dégradation, le transport de soluté, et les mouvements cellulaires. Le protocole décrit ici est un dosage de base pour mesurer l'activité in vitro des ATPases purifiés pour la caractérisation fonctionnelle. Les protéines hydrolysent l'ATP dans une réaction qui entraîne la libération de phosphate inorganique, et la quantité de phosphate libéré est ensuite quantifié en utilisant un dosage colorimétrique. Ce protocole hautement adaptable peut être ajustée pour mesurer l'activité d'ATPase dans les essais cinétiques ou le terminal. Un protocole représentatif est fourni ici sur la base de l'activité et les exigences de Epse, l'AAA + ATPase impliqué dans Type II Sécrétion dans la bactérie Vibrio cholerae. La quantité de protéine purifiée nécessaire pour mesurer l'activité, la durée de l'essai et le moment et le nombre de saintervalles mpling, tampon et de la composition de sel, température, co-facteurs, les stimulants ( le cas échéant), etc. peuvent varier de ceux décrits ici, et donc une certaine optimisation peuvent être nécessaires. Ce protocole fournit un cadre de base pour ATPases caractérisant et peut être effectuée rapidement et facilement ajustée si nécessaire.
Introduction
ATPases sont des enzymes intégrales dans de nombreux processus dans tous les règnes de la vie. Les ATPases agissent comme des moteurs moléculaires qui utilisent l’énergie de l’hydrolyse de l’ATP pour alimenter des réactions aussi diverses que le trafic, le dépliage et l’assemblage des protéines ; réplication et transcription ; métabolisme cellulaire ; mouvement musculaire ; motilité cellulaire ; et le pompage d’ions1-3. Certaines ATPases sont des protéines transmembranaires impliquées dans le transport des solutés à travers les membranes, d’autres sont cytoplasmiques et peuvent être associées à une membrane biologique telle que la membrane plasmique ou cell....
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Protocole
1. Effectuer ATP hydrolyse Réaction avec de la protéine purifiée
- Préparer les stocks de tous les réactifs nécessaires pour incubation avec de la protéine purifiée.
- Préparer 5x HEPES / NaCl / glycérol (HNG) contenant 100 mM de HEPES pH 8,5, 65 mM de NaCl et 5% de glycerol (ou un autre tampon d'essai selon le cas).
- Préparer 100 mM MgCl 2 (ou autre métal, si ATPase est en métal-dépendant) dans l' eau.
- Préparer frais mM ATP 100 dans 200 Tris base mM (ne pas ajuster le pH plus loin) en utilisant la haute ATP de pureté. Aliquoter et stocker le stock ATP à -20 ° C pendant plus de quelques semaines, que l'ATP se ....
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Résultats
L'activité in vitro de la T2S ATPase Epse peut être stimulée par copurification de Epse avec le domaine cytoplasmique de EpsL (Epse-cytoEpsL) et ajout de la cardiolipine phospholipide acide 12. Il est également possible de déterminer le rôle de certains résidus Epse dans hydrolyse de l'ATP en comparant l'activité de type sauvage (WT) des variantes de formes de la protéine à l'aide de ce test. Ici, l'effet de substituer deux résidus de lysine dans l.......
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Discussion
Ceci est un protocole général pour la mesure de l'activité ATPase in vitro de protéines purifiées pour la caractérisation biochimique. Cette méthode est facilement optimisée; par exemple, en ajustant la quantité de protéines, un tampon et des compositions de sel, la température, et à faire varier la durée de l'essai et les intervalles (y compris l'augmentation du nombre total d'intervalles) peut améliorer l'activité de quantification. réactifs verts à base de malachite disponibles d.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Remerciements
Les auteurs tiennent à remercier le financement d’une subvention des National Institutes of Health RO1AI049294 (à M. S.).
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Tampon HEPES | Fisher | BP310-500 | |
| Chlorure de sodium | Fisher | BP358-212 | |
| Chlorure de magnésium | Fisher | BP214-500 | |
| Adénosine triphosphate (ATP) | Fisher | BP41325 | |
| Plaques à 96 puits (transparentes, à fond plat) | VWR | 82050-760 | |
| BIOMOL Green | Enzo Life Sciences | BML-AK111 | Réactif de détection de phosphate préféré. Attention : irritant. |
| Lecteur | BioTek Synergy ou logiciel Prism | ||
| 5 | GraphPad |
Références
- Hanson, P. I., Whiteheart, S. W. AAA+ proteins: have engine, will work. Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (7), 519-529 (2005).
- Baker, T. A., Sauer, R. T. ClpXP, an ATP-powered unfolding and protein-degradation machine. Biochimica et Biophysica Acta. 1823 (1), 15....
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Réimpressions et autorisations
