Mikrofluidik-Pufferaustausch für einen störungsfreien Micro / Nanoparticle Zelltechnik
Summary
Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung eines Trägheits Mikrofluidik-basierten Pufferaustausch Strategie zu Mikro- / Nanopartikel manipulierten Zellen mit einer effizienten Abbau von nicht gebundenen Partikel zu reinigen.
Abstract
Engineering-Zellen, die mit wirkstoffbeladenen Mikro- / Nanopartikel (NPs) ist ein zunehmend beliebte Methode nativen therapeutischen Eigenschaften zu verbessern, Bio-Bildgebung ermöglichen und Zell-Phänotyp steuern. Eine kritische noch unzureichend angesprochen Problem ist die beträchtliche Anzahl von Teilchen, die nach der Zellmarkierungs ungebunden bleiben, die nicht leicht durch herkömmliche Zentrifugation entfernt werden kann. Dies führt zu einer Erhöhung der bio Abbildungshintergrundrauschen und transformierende Wirkung auf benachbarte Nicht-Zielzellen vermitteln. In diesem Protokoll präsentieren wir ein Trägheits Mikrofluidik-basierten Pufferaustausch Strategie bezeichnet als Dean Flow Fractionation (DFF), um effizient markierten Zellen von freien Nanopartikeln in einem hohen Durchsatz Weise trennen. Die entwickelte Spiralmikrovorrichtung ermöglicht eine kontinuierliche Sammlung (> 90% Zell recovery) von gereinigten Zellen (THP-1 und MSCs) in neue Pufferlösung suspendiert, während> 95% Abreicherung von ungebundenen Fluoreszenzfarbstoff zu erreichen oder farbstoffbeladenen NPs (silica oder PLGA). Dieses einstufige, größenbasierte Zellreinigungsstrategie ermöglicht hohe Zellverarbeitungsdurchsatz (10 6 Zellen / min) und ist sehr nützlich für die großvolumige Zelle Reinigung von Mikro- / Nanopartikel – Zellen entwickelt , störungsfreie klinische Anwendung zu erzielen.
Introduction
Zellen , die durch agenten geladen Mikro- / Nanopartikel (NPs) ist eine einfache, genomische Integration frei und vielseitige Methode zur Bioimaging – Fähigkeit zu verbessern und zu erweitern / Ergänzung seiner nativen therapeutischen Eigenschaften in der regenerativen Medizin – Engineering. 1-3 Cellular Modifikationen erreicht werden durch die Kennzeichnung Plasmamembran oder Zytoplasma mit einem Überschuss Konzentration des Mittels belasteten NPs die Bindungsstellen zu sättigen. Jedoch ist ein Hauptnachteil dieses Verfahrens , die signifikante Mengen an ungebundenen Partikel in Lösung verbleibt nach dem Zellmarkierungsverfahren, die möglicherweise eine genaue Identifizierung von partikel manipulierten Zellen vermengen können oder therapeutische Ergebnisse erschweren. 4,5 Zusätzlich Exposition gegen NPs enthält transformierende Mittel (Wachstumsfaktoren, Kortikosteroide, etc.) bei zu hoher Konzentration kann Zytotoxizität und misdirected Exposition verursachen unerwünschte Folgen auf nicht-Zielzellen induzieren kann. partikuläre Träger Selbst umfassend of "biokompatibel" Materialien [zB Poly (milch co-Glykolsäure), PLGA] kann auch potente Immunzell – Reaktionen unter bestimmten Bedingungen anstiften. 6 Dieses bei Personen mit eingeschränkter Immunität besonders riskant ist (zB rheumatoide Arthritis) , die möglicherweise Verzögerungen systemische Clearance Nanopartikels. 7 somit effiziente Entfernung von freien Teilchen vor der Einführung des partikel manipulierten Zellen ist von großer Bedeutung Toxizitätsprofil zu minimieren und misdirected Exposition gegenSubstanz beladenen Partikel in vivo reduzieren.
Herkömmliche Gradientenzentrifugation wird oft zu trennen manipulierten Zellen von freien Teilchen verwendet, ist aber umständlich und im Batch-Modus betrieben werden. Darüber hinaus kann durch Zellen erfahrenen Scherspannungen während des hochtourigen Zentrifugation und die Bestandteile des Dichtegradientenmedium kompromittieren Integrität Zelle und / oder Beeinflussung des Zellverhaltens. 8 Microfluidics ist eine attraktive Alternative mit sevrere Trenntechnologien einschließlich deterministische seitliche Verschiebung (DLD) 9, dieletrophoresis 10,11 und acoustophoresis 12 kleine Partikel Trennung und Pufferaustausch – Anwendungen entwickelt wurde. Jedoch leiden diese Methoden von geringem Durchsatz (1-10 & mgr; l · min – 1) und sind anfällig für Probleme zu verstopfen. Aktive Trennungen wie Dielektrophorese-basierten Verfahren benötigen auch Unterschiede in der intrinsischen dielektrophoretischen Zellphänotypen oder zusätzliche Zellmarkierungsschritte zur Trennung erzielen. Ein vielversprechender Ansatz beinhaltet Trägheits Mikrofluidik – die seitliche Wanderung der Partikel oder Zellen über rationalisiert an bestimmten Positionen durch dominante Auftriebskräfte (F L) bei hohen Reynolds – Zahl (Re) 13 Aufgrund der hohen Strömungsverhältnisse und überlegene Größe Auflösung zu konzentrieren. ist es oft für größenbasierte Zellseparation 14,15 und Pufferaustausch – Anwendungen genutzt werden . 16-18 However, Pufferaustauschleistung bleibt mit ~10-30% Verunreinigung Lösung schlecht wie die getrennten Zellen in der Regel zwischen ursprünglichen und neuen Pufferlösungen an die Grenze dicht bleiben. 16-18 Noch wichtiger ist , hat auf die Größenverteilung von Zielzellen ähnlich sein zu erreichen , präzise Trägheits Fokussierung und Trennung von der ursprünglichen Pufferlösung , die ein Problem insbesondere bei der Verarbeitung von heterogenen großen Zelltypen wie mesenchymalen Stammzellen (MSCs) darstellt. 19
Wir haben bereits eine neue Trägheits Mikrofluidik Zellsortierung Technik bezeichnet Dean Flow Fractionation (DFF) zur Isolierung von zirkulierenden Tumorzellen (CTC) 20 und Bakterien 21 aus Vollblut unter Verwendung eines 2-Eingang, 2-Auslass Spiralmikrokanalgerät entwickelt. In diesem Video-Protokoll, werden wir den Prozess der Etikettierung THP-1 (humane akute monozytäre Leukämie-Zelllinie) Suspension monozytären Zellen (~ 15 & mgr; m) und MSCs (10-30 & mgr; m) mit Calcein-l beschreibenoaded NPs, gefolgt von der Herstellung und dem Betrieb der DFF Spiralmikrovorrichtung zur effizienten Rückgewinnung von markierten Zellen und das Entfernen von ungebundenem NPs. 22 Diese einstufigen Reinigungsstrategie ermöglicht eine kontinuierliche Rückgewinnung von markiertem Suspension und haft in frische Pufferlösung ohne Zentrifugation suspendierten Zellen. Darüber hinaus kann es bis zu 10 Millionen Zellen verarbeiten · ml -1, eine Zelldichte zugänglich für die regenerative Medizin – Anwendungen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das DFF Zellreinigung hier beschriebene Technologie ermöglicht eine schnelle und kontinuierliche Trennung der markierten Zellen in einem Hochdurchsatz Weise. Diese Trennung Ansatz ist ideal für große Probenvolumen oder hohe Zellkonzentration Probenverarbeitung und ist besser als herkömmliche Membranbasis Filtration, die zu einer Verstopfung nach längerem Gebrauch anfällig ist. In ähnlicher Weise Affinität basierende magnetische Trennung erfordert eine zusätzliche Markierung von Zellen Schritte, die aufwendig un…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Kind gift of THP-1 cells from Dr. Mark Chong and assistance in microfabrication from Dr. Yuejun Kang and Dr. Nishanth V. Menon (School of Chemical and Biomedical Engineering, Nanyang Technological University) were greatly acknowledged. This project was funded by NTU-Northwestern Institute of Nanomedicine (Nanyang Technological University). H.W.H. was supported by Lee Kong Chian School of Medicine (LKCMedicine) postdoctoral fellowship.
Materials
| Cell lines & Media | |||
| Mesenchymal Stem Cells (MSCs) | Lonza | PT-2501 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Lonza | 12-614F | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10270-106 | |
| THP-1 monocyte cells (THP-1) | ATCC | TIB-202 | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 media | Lonza | 12-702F | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Reagents & Materials | |||
| 0.01% poly-L-lysine (PLL) | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| 3 mL Syringe | BD | 302113 | Syringe 3ml Luer-Lock |
| 60 ml Syringe | BD | 309653 | Syringe 60ml Luer-Lock |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Biowest | P6154-100GR | |
| Calcein, AM (CAM) | Life Technologies | C1430 | |
| Calcein | Sigma-Aldrich | C0875 | |
| Isopropanol | Fisher Chemical | #P/7507/17 | HPLC Grade 2.5 L |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Lonza | 17-516Q/12 | |
| Plain Microscope Slides | Fisher Scientific | FIS#12-550D | 75 X 25 X 1 mm |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning | SYLGARD® 184 | |
| Scotch tape | 3M | 21200702044 | 18mm x 25m |
| Silica NPs (∼200 μm) | Sigma-Aldrich | 748161 | Pore size 4 nm |
| Syringe Tip | JEC Technology | 7018302 | 23GA .013 X .25 |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Life Technologies | 25200-056 | |
| Tygon Tubing | Spectra-Teknik | 06419-01 | .02X.06" 100 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Equipment | |||
| Biopsy punch | Harris Uni-Core | 69036-15 | 1.50 mm |
| Dessicator | Scienceware | 111/4 IN OD | |
| High-speed Camera | Phantom | V9.1 | |
| Inverted phase-contrast microscope | Nikon | Eclipse Ti | |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-002 | |
| Syringe Pump | Chemyx | CX Fusion 200 | |
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