In vitro et dans des modèles in vivo pour étudier la transition cornéenne endothéliale-mésenchymateuses

Résumé

Une culture primaire de cellules endothéliales de cornée bovine a été utilisée pour étudier le mécanisme de transition endotheliale de la cornée mésenchymateuses. En outre, un modèle d'endothélium cornéen cryolésion de rat a été utilisé pour démontrer la transition de l' endothélium de la cornée mésenchymateuses in vivo.

Résumé

Les cellules endothéliales cornéennes (CEC) jouent un rôle crucial dans le maintien de la clarté cornéenne grâce à un pompage actif. Une réduction du nombre de CEC peut entraîner un œdème cornéen et une diminution de l’acuité visuelle. Cependant, les CEC humaines sont sujettes à un potentiel prolifératif compromis. De plus, la stimulation de la croissance cellulaire est souvent compliquée par la transition endothéliale-mésenchymateuse progressive (EnMT). Par conséquent, il est nécessaire de comprendre le mécanisme de l’EnMT pour faciliter la régénération des CEC ayant une fonction compétente. Dans cette étude, nous avons préparé une culture primaire de CEC bovines en épluchant les CEC avec la membrane de Descemet du bouton cornéen et démontré que les CEC bovines présentaient le processus EnMT, y compris le changement phénotypique, la translocation nucléaire de la β-caténine et les régulateurs EMT escargot et limace, dans la culture in vitro. De plus, nous avons utilisé un modèle de cryolésion de l’endothélium cornéen de rat pour démontrer le processus EnMT in vivo. Collectivement, la culture primaire in vitro de CEC bovines et de modèles in vivo de cryolésions de l’endothélium cornéen de rat offre des plateformes utiles pour étudier le mécanisme de l’EnMT.

Introduction

Les cellules endothéliales cornéennes (CEC) jouent un rôle essentiel dans le maintien de la clarté cornéenne et donc de l’acuité visuelle en régulant l’état d’hydratation du stroma cornéen par un pompage actif¹. En raison du potentiel prolifératif limité des CEC humaines, le nombre de cellules diminue avec l’âge, et la réparation des plaies endothéliales cornéennes après une blessure est généralement réalisée par l’élargissement et la migration cellulaires, plutôt que par la mitose cellulaire². Lorsque le nombre de CEC diminue en dessous d’un seuil d’environ 500 cellules/^mm2, l’état de déshydratation du stroma cornéen ne peut pas être ....

Protocole

Toutes les procédures suivies dans cette étude accordée à l'Association pour la recherche en vision et ophtalmologie Déclaration pour l'utilisation des animaux dans ophtalmique et Vision Research et ont été approuvés par le soin et l'utilisation des animaux Commission institutionnelle du National Taiwan University Hospital.

1. Isolement, Culture Préparation primaire, et immunocoloration de Bovine CECs

1. Acquérir les yeux frais de bovins à partir d'un abattoir local.
2. Désinfecter les yeux d'une solution aqueuse à 10% p / v povidone-iode pendant 3 min. les laver avec une solution saline (PBS), une solution tamponnée au phos....

Résultats

Après l'isolement du PEC bovine, les cellules ont été cultivées in vitro. La figure 1 présente les images de contraste de phase de la CEC bovine. La forme hexagonale des cellules à confluence indiqué que les cellules ne sont pas contaminés par la cornée fibroblaste stromale lors de l' isolement cellulaire. La figure 2 représente la immunocoloration qui a été effectuée en utilisant des anticorps contre ABC, escargot, et slug à un point de.......

Discussion

CECs sont connus pour leur propension à subir des EnMT pendant la prolifération cellulaire. Pour élaborer des stratégies pour supprimer le processus EnMT à des fins thérapeutiques, une compréhension approfondie du mécanisme EnMT est nécessaire. Nous avons décrit 2 modèles pour étudier EnMT, à savoir la CCE bovine dans le modèle de culture in vitro et le rat endothélium cornéen modèle cryolésion. Nos résultats ont démontré le processus EnMT dans les deux modèles. En outre, l'effet de suppression de .......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
trypsine	ThermoFisher Scientific	12604-013
Dulbecco' milieu Eagle modifié et milieu F12 de Ham	ThermoFisher Scientific	11330
sérum fœtal bovin	ThermoFisher Scientific	26140-079
diméthylsulfoxyde	Sigma	D2650
facteur de croissance épidermique humain	ThermoFisher Scientific	PHG0311
insuline, transferrine, sélénium  ;	ThermoFisher Scientific	41400-045
toxine cholérique	Sigma	C8052-1MG
gentamicine	ThermoFisher Scientific	15750-060
amphotéricine B	ThermoFisher Scientific	15290-026
paraformaldéhyde	Microscopie électronique	Sciences 111219
Triton X-100	Sigma	T8787  ;
albumine sérique bovine	Sigma	A7906
marimastat	Sigma	M2699-25MG
anticorps anti-bêta-caténine anti-actif	Millpore	05-665
anticorps anti-escargot	Santa cruz	sc28199
anticorps anti-limace	Santa cruz	sc15391
chèvre anti-souris IgG (H+L) secondaire anticorps	ThermoFisher Scientific	A-11001	pour la coloration de l’ABC des CEC bovins
Anticorps secondaires IgG (H+L) anti-souris	ThermoFisher Scientific	A-11003	pour la coloration de l’ABC de l’endothélium cornéen du rat
Anticorps IgG (H+L) secondaire anti-lapin	ThermoFisher Scientific	A-11008	pour la coloration de l’escargot et de la limace des CEC bovins
Diluant d’anticorps	Genemed Biotechnologies	10-0001
4',6-diamidino-2-phénylindole	ThermoFisher Scientific	D1306
support de montage	Vector Laboratories	H-1000
microscope confocal à balayage laser	ZEISS	LSM510
xylazine  ;	Bayer	N/A
tilétamine plus zolazépam	Virbac	N/A	médicament vétérinaire
chlorhydrate de proparacaïne solution ophtalmique	Alcon	N/A	médicament vétérinaire
0,1 % atropine	Wu-Fu Laboratories Co., Ltd	N/A	médicament clinique  ;
Sulfate de gentamicine à 0,3 %	Sinphar Groupe	N/A	médicament clinique  ;
facteur de croissance des fibroblastes de base	ThermoFisher Scientific	PHG0024	médicament clinique  ;