Addition of a tag to a protein is a powerful way of gaining insight into its function. Here, we describe a protocol to endogenously tag hundreds of Trypanosoma brucei proteins in parallel such that genome scale tagging is achievable.
Improvements in mass spectrometry, sequencing and bioinformatics have generated large datasets of potentially interesting genes. Tagging these proteins can give insights into their function by determining their localization within the cell and enabling interaction partner identification. We recently published a fast and scalable method to generate Trypanosoma brucei cell lines that express a tagged protein from the endogenous locus. The method was based on a plasmid we generated that, when coupled with long primer PCR, can be used to modify a gene to encode a protein tagged at either terminus. This allows the tagging of dozens of trypanosome proteins in parallel, facilitating the large-scale validation of candidate genes of interest. This system can be used to tag proteins for localization (using a fluorescent protein, epitope tag or electron microscopy tag) or biochemistry (using tags for purification, such as the TAP (tandem affinity purification) tag). Here, we describe a protocol to perform the long primer PCR and the electroporation in 96-well plates, with the recovery and selection of transgenic trypanosomes occurring in 24-well plates. With this workflow, hundreds of proteins can be tagged in parallel; this is an order of magnitude improvement to our previous protocol and genome scale tagging is now possible.
Trypanosoma brucei er en protozo parasit, der forårsager human afrikansk trypanosomasis og nagana hos kvæg. T. brucei er et ideelt organisme til analyse af protein funktion på grund af kombinationen af en høj kvalitet genom, talrige proteomics og transcriptomics datasæt og veludviklede molekylære værktøjer 1-3. Fremskridt i proteomics og sekventering har resulteret i store datasæt, der fremhæver potentielt interessante gener 4-6; dog mange gener har minimal oplysninger i forbindelse med dem i de eksisterende databaser. Der er derfor et behov for en high-throughput metode til at hjælpe protein funktionel karakterisering.
Ekspression af et kodet protein kan give en flerhed af indsigt i et proteins funktion. For eksempel kan et protein mærket med et fluorescerende protein eller epitop være lokaliseret ved fluorescens mikroskopi, som giver oplysninger om, hvor protEin kan udøve dets biologiske virkning. Alternativt et protein mærket med en TAP 7, HaloTag 8 eller His-tag kan oprenses til biokemiske assays og identifikation af dets samspil partnere.
Vi har for nylig udviklet en robust tagging metode til T. brucei 9. Dette bruges lange primer PCR til at generere DNA til transfektion og tillod tagging af snesevis af proteiner i parallel – en væsentlig forbedring af eksisterende protokoller. Vi har nu forbedret skalerbarhed af denne protokol i procykliske former af en størrelsesorden. Her præsenteres vores metode, hvor vi udfører PCR og transfektion i 96-brønds plader, med genvinding og udvælgelse forekommer i 24-brønds plader. Hundredvis af proteiner nu kan mærkes parallelt denne fremgangsmåde tilvejebringer en omkostningseffektiv og gennemførlig metode til mærkning af hele trypanosominfektion genomet.
Dramatiske forbedringer i følsomhed proteomics og transcriptomics metoder i de sidste 5-10 år har givet værdifulde data på tusinder af gener og deres produkter. Men til de værktøjer fat funktionen af disse proteiner har ikke holdt trit.
Tagging et protein letter talrige eksperimenter for at bestemme dens funktion. For eksempel kan et protein være fusioneret til et fluorescerende protein i en række forskellige farver til at lette lokaliserings- og co-lokalisering undersøgelser. Tags udviklet til elektronmikroskopi, såsom APEX2 eller miniSOG 11,12, tillade ultrastrukturelle lokalisering af mærkede protein. Tags til biokemi, såsom TAP-tag, og ProtC-TEV-ProtA (PTP) tagge 7,13 tillader oprensning af komplekser, der er forbundet med proteinet til identifikation af bindingspartnere eller in vitro biokemiske assays.
De specifikke trin, der er afgørende for succes af protocol er: inkorporeringen af DMSO i PCR Master Mix 1, frysning af PCR Master Mix 1 før tilsætningen af Master Mix 2, brug af den kommercielle polymerase i Master Mix 2 og ændringen af cytomix elektroporation buffer. Det er vores erfaring, er det nødvendigt at anvende fordoble antallet af celler efter C-terminal tagging transfektioner som for N-terminal tagging transfektioner for at opnå en lignende andel af positive brønde. Derfor skal udføres alle trin som beskrevet.
Denne teknik er kun forventes at blive en succes, når transfektion insekt procyklisk formular trypanosominfektion. Blodbanen former har en lavere transfektionseffektivitet 14 i øvrigt er de tilbøjelige til at dø i løbet af udvælgelsen på grund af tætheden-afhængig toksicitet, som er relateret til det selektive stof. Derfor er vores tidligere protokol repræsenterer den aktuelle bedste teknologi til kodning af blodbanen formular trypanosomer 9. Det er også sandsynligt, at den transinfektion effektivitet vil variere afhængig af den specifikke trypanosominfektion isolat. Denne protokol blev optimeret ved hjælp af 927 SMOX procykliske former – andre stammer kan kræve yderligere optimering. Foranstaltninger, der kan øge sandsynligheden for succes omfatter: at øge mængden af PCR-amplikon, øge antallet af celler, der indgår i transfektion.
Vi præsenterer en fremgangsmåde, hvor hundredvis af proteiner kan mærkes parallelt. Dette vil lette undersøgelser i stor skala på lokalisering og interaktion, der supplerer de eksisterende store datasæt og giver uvurderlig information til samfundet. Primer skabeloner er tilgængelige efter anmodning og en liste over plasmider skabeloner er tilgængelig fra: http://www.sdeanresearch.com/
The authors have nothing to disclose.
SD was supported by a Sir Henry Wellcome Fellowship [092201/Z/10/Z]. This work was funded by Wellcome Trust grants [WT066839MA][104627/Z/14/Z][108445/Z/15/Z] to Professor Keith Gull. We would like to thank Professor Keith Gull for helpful conversations and insights.
Oligonucleotide | Life technologies | na | desalt only (do not use additional purification) |
DMSO | Roche | Included with the Expand HiFi pack | Must be PCR grade |
dNTP | any reputable | ||
Expand HiFi polymerase | Roche | 11759078001 | |
BTX ECM830 | Harvard Apparatus | Electroporator | |
HT-200 plate handler | Harvard Apparatus | HT-200 | Handles the 96-well eletroplates |
MOS 96 ELECTROPLATE 4mm | Harvard Apparatus | 45-0452 | Electroplate for the 96-well electroporation |
Blasticidin S Hydrochloride | Melford | 3513-03-9 | |
Hygromycin b Gold | Invivogen | ant-hg-1 | |
Phleomycin | Melford | P0187 | |
225cm TC Flask, canted neck, phenolic cap | Appletonwoods | BC006 | |
24 well culture plates | Appletonwoods | BC017 | |
Eppendorf® PCR Cooler, iceless cold storage system for 96 well plates and PCR tubes | Sigma Aldrich | Z606634-1EA | |
96-well Multiply® PCR plate with lateral skirt | Sarstedt | 72.1979.203 |