Comparison of Tobacco Host Cell Protein Removal Methods by Blanching Intact Plants or by Heat Treatment of Extracts

Johannes F. Buyel; J&#252;rgen Hubbuch; Rainer Fischer

doi:10.3791/54343

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Biologie

Confronto di tabacco metodi Host cellulare della proteina di rimozione da Blanching Piante intatte o mediante trattamento termico di estratti

Published: August 08, 2016

doi:

10.3791/54343

Johannes F. Buyel², Jürgen Hubbuch, Rainer Fischer²

¹Fraunhofer Institute for Molecular Biology and Applied Ecology IME,Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e. V., ²Institute for Molecular Biotechnology,RWTH Aachen University, ³Department of Biomolecular Separation Engineering,Karlsruhe Institute of Technology (KIT)

Summary

Tre calore metodi di precipitazione sono presentati che rimuove efficacemente oltre il 90% delle proteine della cellula ospite (HCP) da tabacco estrae prima di qualsiasi altra fase di purificazione. L'impianto di operatori sanitari in modo irreversibile aggregare a temperature superiori a 60 ° C.

Abstract

Le piante non solo forniscono alimenti, mangimi e materie prime per l'uomo, ma sono stati sviluppati come un sistema di produzione economica per le proteine biofarmaceutiche, come gli anticorpi, vaccini candidati ed enzimi. Questi devono essere purificati dalla biomassa vegetale, ma passaggi di cromatografia sono ostacolati dalle alte concentrazioni di proteine della cellula ospite (operatori sanitari) in estratti di piante. Tuttavia, la maggior parte HCPs irreversibilmente aggregano a temperature superiori a 60 ° C agevolare successiva purificazione della proteina bersaglio. Qui, tre metodi vengono presentati per ottenere la precipitazione di calore degli operatori sanitari del tabacco in foglie sia intatte o estratti. Il pallore di foglie intatte può essere facilmente incorporato in processi esistenti, ma può avere un impatto negativo sulle successive fasi di filtrazione. L'opposto è vero per la precipitazione di calore di estratti di foglie in un recipiente agitato, che può migliorare le prestazioni delle operazioni a valle anche se con grandi cambiamenti nella progettazione apparecchiature di processo, qualiGeometria omogeneizzatore. Infine, una configurazione scambiatore di calore è ben caratterizzato in termini di condizioni di trasferimento di calore e facile in scala, ma pulizia può essere difficile e potrebbe esserci un impatto negativo sulla capacità del filtro. L'approccio progettuale-di-esperimenti può essere utilizzato per identificare i parametri di processo più importanti che influenzano la rimozione HCP e recupero del prodotto. Questo facilita l'applicazione di ciascun metodo in altre piattaforme di espressione e l'identificazione del metodo più adatto per una data strategia di purificazione.

Introduction

I moderni sistemi di assistenza sanitaria dipendono sempre più sulle proteine biofarmaceutiche ^1. Produrre queste proteine nelle piante è vantaggioso a causa del basso carico patogeno e maggiore scalabilità rispetto ai sistemi di espressione convenzionali ^2-4. Tuttavia, la lavorazione a valle (DSP) di farmaci di origine vegetale può essere difficile perché le procedure di estrazione dirompenti si traducono in un onere elevato di particelle, con torbidità superiore a 5.000 unità nefelometrica torbidità (NTU), e di proteine della cellula ospite (HCP) concentrazioni spesso superiore a 95 % [m / m] ^5,6.

Procedure di chiarificazione elaborati sono tenuti a rimuovere particelle disperse ^7-9, ma l'apparecchiatura cromatografia è meno costoso per operare in modalità bind-and-eluire durante il recupero iniziale del prodotto se c'è un passaggio precedente per la rimozione efficiente degli operatori sanitari ^10,11. Ciò può essere ottenuto sia da precipitare la proteina bersaglio utilizzando flocculformiche ¹² o basso pH ^13,14, così come provocando la operatori sanitari di aggregare. L'aggregazione selettiva di ribulosio-1,5-bisfosfato carbossilasi / ossigenasi (Rubisco), l'operatore sanitario più abbondante nelle piante verdi come il tabacco (Nicotiana tabacum), può essere promossa aggiungendo polietilene glicole ^15, ma questo è costoso e incompatibile con grande la produzione -scale. Il trattamento termico è stato dimostrato per denaturare e precipitare più del 95% degli operatori sanitari tabacco, mentre vaccini candidati proteina malaria come Vax8 rimangono stabili in soluzione ^16-18.

Tre diversi approcci sono stati usati per ottenere la precipitazione indotta dal calore degli operatori sanitari tabacco: (i) la scottatura, cioè, l'immersione delle foglie intatte in liquido caldo, (ii) una temperatura controllata agitata nave, e (iii) uno scambiatore di calore ( Figura 1) ^16. Per foglie intatte, scottatura raggiunto la precipitazione rapida ed efficace degli operatori sanitari ed era anche facilea scalare e compatibile con i processi di produzione su larga scala esistenti che includono un primo passo per lavare la biomassa vegetale ^19. Al contrario, navi temperatura controllata sono già disponibili in alcuni processi e possono essere utilizzati per il trattamento termico di estratti vegetali ^20, ma la loro scalabilità e velocità di trasferimento di energia è limitato perché il rapporto superficie-volume dei serbatoi è progressivamente ridotta e diventa inadatto a scala processo. Uno scambiatore di calore è un'alternativa tecnicamente ben definito per riscaldata navi agitate ma richiede un abbondante approvvigionamento di riscaldamento e mezzi di raffreddamento, ad esempio, vapore e acqua fredda, nonché una portata volumetrica strettamente controllato atto a geometria scambiatore di calore e proprietà dei media, ad esempio., la capacità termica specifica. Questo articolo mostra come tutti i tre metodi possono essere usati per la precipitazione indotta dal calore degli operatori sanitari tabacco e HCPs vegetali in genere. L'istituzione e il funzionamento di EACMetodo h in un ambiente di laboratorio può essere utilizzato per valutare la loro idoneità per processi su larga scala. La sfida principale è quello di individuare modelli in scala-down adeguati e condizioni di funzionamento per ogni operazione che assomigliano i dispositivi e le condizioni utilizzate durante la produzione processo di scala. I dati qui presentati si riferiscono ad esperimenti condotti con piante di tabacco transgeniche che esprimono la malaria candidato vaccino Vax8 e proteina fluorescente DsRed ^16, ma il metodo è stato applicato con successo anche a N. piante benthamiana esprimere transitoriamente altre proteine biofarmaceutiche ^21.

Un design-di-esperimenti (DOE) si avvicinano ²² può facilitare lo sviluppo di processo, e flocculanti ²³ può anche essere utile in questo contesto, come descritto in precedenza ^8. La differenza principale tra la scottatura, serbatoi riscaldati e scambiatori di calore è che sbiancamento viene applicata alle foglie intatte nelle prime fasi del processo mentre l'otlei sono applicati a estratti vegetali (Figura 1).

Figura 1:. Processo Schema di flusso che illustra la realizzazione di tre diversi metodi per il tabacco HCP calore Precipitazioni Il materiale vegetale è lavato ed omogeneizzato prima chiarificazione e purificazione. L'attrezzatura per il passo scottatura (rosso) può essere facilmente aggiunto al macchinario esistente. Al contrario, utilizzando un recipiente agitato (arancione) e, soprattutto, uno scambiatore di calore (blu) richiede uno o più dispositivi e tubi aggiuntivi. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Protocol

1. Coltivare le piante di tabacco Lavare ogni blocco lana minerale con 1 a 2 L di acqua deionizzata e quindi con 1 L di 0,1% [w / v] Soluzione di concime. Mettere un seme di tabacco in ogni blocco lana minerale e delicatamente a filo con 0,25 L di soluzione fertilizzante senza lavare via il seme 16. Coltivare le piante di tabacco per 7 settimane in una serra con il 70% di umidità relativa, 16 hr fotoperiodo (180 mmol sec – 1 m – 2; λ = 400 – 7…

Representative Results

La precipitazione di calore delle proteine della cellula ospite tabacco da scottatura La procedura di sbiancamento descritto nella sezione 2. è stato utilizzato con successo per far precipitare operatori sanitari da foglie di tabacco con 70 ° C, la riduzione del TSP del 96 ± 1% (n = 3), mentre il recupero fino al 51% della proteina bersaglio Vax8, aumentando così la sua purezza dal 0,1% al 1,2% prima della separazione cromatografica 16. Era anche poss…

Discussion

I tre metodi per la precipitazione di calore sopra descritti possono rimuovere efficacemente operatori sanitari tabacco prima di ogni fase di purificazione cromatografica ^16,17. Esse completano altre strategie che mirano ad aumentare la purezza iniziale del prodotto, ad esempio, guttazione ^29, rhizosecretion ³⁰ o centrifuga estrazione ^31,32, che sono tutti limitati alle proteine secrete. Tuttavia, i metodi di calore a base possono essere usati solo in modo signi…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We would like to acknowledge Dr. Thomas Rademacher, Alexander Boes and Veronique Beiß for providing the transgenic tobacco seeds, and Ibrahim Al Amedi for cultivating the tobacco plants. The authors wish to thank Dr. Richard M. Twyman for editorial assistance as well as Güven Edgü for providing the MSP1-19 reference. This work was funded in part by the European Research Council Advanced Grant ”Future-Pharma”, proposal number 269110, the Fraunhofer-Zukunftsstiftung (Fraunhofer Future Foundation) and Fraunhofer-Gesellschaft Internal Programs under Grant No. Attract 125-600164.

Materials

2100P Portable Turbidimeter	Hach	4650000	Turbidimeter
Amine Coupling Kit	GE Healthcare	BR100050	SPR chip coupling kit
Autoclaving basket	Nalgene	6917-0230	Basket for leaf blanching
Biacore T200	GE Healthcare	28-9750-01	SPR device
Bio Cell Analyser BCA 003 R&D with 3D ORM	Sequip	n.a.	Particle size analyzer
Blender	Waring	800EG	Blender
BP-410	Furh	2632410001	Bag filter
Centrifuge 5415D	Eppendorf	5424 000.410	Centrifuge
Centrifuge tube 15 mL	Labomedic	2017106	Reaction tube
Centrifuge tube 50 mL self-standing	Labomedic	1110504	Reaction tube
CM5 chip	GE Healthcare	BR100012	Chip for SPR measurements
Cuvette 10x10x45	Sarsted	67.754	Cuvette for Zetasizer Nano ZS
Design-Expert(R) 8	Stat-Ease, Inc.	n.a.	DoE software
Disodium phosphate	Carl Roth GmbH	4984.3	Media component
Ferty 2 Mega	Kammlott	5.220072	Fertilizer
Forma -86C ULT freezer	ThermoFisher	88400	Freezer
Greenhouse	n.a.	n.a.	For plant cultivation
Grodan Rockwool Cubes 10x10cm	Grodan	102446	Rockwool block
Twentey-loop heat exchanger (4.8 m length)	n.a. (custom design)	n.a.	Heat exchanger
HEPES	Carl Roth GmbH	9105.3	Media component
K200P 60D	Pall	5302303	Depth filter layer
KS50P 60D	Pall	B12486	Depth filter layer
Lauda E300	Lauda Dr Wobser GmbH	Z90010	Water bath thermostat
L/S 24	Masterflex	SN-06508-24	Tubing
mAb 5.2	American Type Culture Collection	HB-9148	Vax8 specific antibody
Masterflex L/S	Masterflex	HV-77921-75	Peristaltic pump
Miracloth	Labomedic	475855-1R	Filter cloth
MultiLine Multi 3410 IDS	WTW	WTW_2020	pH meter / conductivity meter
Osram cool white 36 W	Osram	4930440	Light source
Phytotron	Ilka Zell	n.a.	For plant cultivation
Sodium disulfit	Carl Roth GmbH	8554.1	Media component
Sodium chloride	Carl Roth GmbH	P029.2	Media component
Stainless-steel vessel; 0.7-kg 2.0-L; height 180 mm; diameter 120 mm	n.a. (custom design)	n.a.	Container for heat precipitation
Synergy HT	BioTek	SIAFRT	Fluorescence and spectrometric plate reader
VelaPad 60	Pall	VP60G03KNH4	Filter housing
Zetasizer Nano ZS	Malvern	ZEN3600	DLS particle size distribution measurement
Zetasizer Software v7.11	Malvern	n.a.	Software to operate the Zetasizer Nano ZS device

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Buyel, J. F., Hubbuch, J., Fischer, R. Comparison of Tobacco Host Cell Protein Removal Methods by Blanching Intact Plants or by Heat Treatment of Extracts. J. Vis. Exp. (114), e54343, doi:10.3791/54343 (2016).