Protokol til isolering af Mouse Circle of Willis
Summary
We describe here a reproducible protocol for isolating the mouse circle of Willis.
Abstract
Den cerebral arteriel cirkel (Circulus arteriosus cerebri) eller kreds af Willis (CoW) er en kredsløbssygdomme anastomose omkring optiske chiasma og hypothalamus, der leverer blod til hjernen og de omkringliggende strukturer. Det har været impliceret i flere cerebrovaskulære lidelser, herunder cerebral amyloid angiopati (CAA) associeret vaskulopatier, intrakraniel aterosklerose og intrakranielle aneurismer. Undersøgelser af de molekylære mekanismer bag disse sygdomme til identifikation af nye lægemiddelkandidater til forebyggelse kræver dyremodeller. Nogle af disse modeller kan være transgene, mens andre vil involvere isolering af det cerebro-vaskulære gebet, herunder CoW.The her beskrevne fremgangsmåde er velegnet til CoW isolering i nogen mus afstamning og har et stort potentiale for screening (ekspression af gener, proteinproduktion, posttranslationelle protein modifikationer, secretome analyse, etc.) undersøgelser af de store skibe med musen cerebralekar. Den kan også anvendes til ex vivo undersøgelser, ved at tilpasse organbadet system udviklet for isolerede mus olfaktoriske arterier.
Introduction
Den cerebral arteriel cirkel (Circulus arteriosus cerebri), også kendt som kredsen af Willis (CoW), løkke af Willisor Willis polygon) blev først beskrevet af Thomas Willis i 1664. Det er en kredsløbssygdomme anastomose placeret omkring den optiske chiasma og hypothalamus, der kan betragtes som et centralt knudepunkt tilfører blod til hjernen og omgivende strukturer. Blod ind denne struktur via den interne carotis og vertebrale arterier, og det strømmer ud af cirklen via den indvendige midten og posteriore cerebrale arterier. Hver af disse arterier har venstre og højre grene på hver side af cirklen. Basilar, post kommunikerer, og anterior kommunikerer arterier komplet cirklen (figur 1 og figur 2). Risikoen for nedsat blodgennemstrømning i nogen af de udadgående arterier minimeres ved sammenlægning af blod ind i cirkel fra carotis og cerebrale arterier, hvilket sikrer, at tilstrækkelig blod tilføres til Bregn. Denne struktur fungerer også som den vigtigste rute for sikkerhedsstillelse blodgennemstrømningen i alvorlige okklusive sygdomme i det indre halspulsåre.
Flere typer af cerebrovaskulære sygdomme har deres oprindelse i koen. De mest almindelige er cerebral amyloid angiopati (CAA) associeret vaskulopatier, intrakraniel aterosklerose og intrakranielle aneurismer. 1, 2, 3 Disse lidelser kan føre til hypoperfusion grund vasodilation, og intracerebral og / eller subaraknoidal blødning i sidste ende omsætte til iskæmiske eller hæmoragisk slagtilfælde eller i bedste fald en forbigående iskæmisk anfald. Nylige fremskridt i diagnostiske procedurer, herunder Neuroimaging, eventuelt kombineret med angiografi, har gjort det muligt at diagnosticere disse store cerebrovaskulære sygdomme klinisk, uden behov for en hjerne biopsi. Ikke desto mindre er effektive og specifikke behandlinger (farmakologiske eller endovaskulære) øjeblikket mangler, og der er derfor behov for at definere nyemolekylære mål.
Identifikationen af nye lægemiddelkandidater til forebyggelse af disse sygdomme hos mennesker vil kræve dyremodeller og måder at isolere cerebro-kar herunder koen. Sådanne modeller skal fremlægge dokumentation for og spor til de specifikke ændringer, herunder inflammatoriske forandringer, der forekommer i væggene i de store skibe i dyremodeller af intrakraniel arterie aneurisme, CAA eller intrakraniel åreforkalkning. 4, 5, 6
Vi har etableret en metode til mus CoW isolation for at lette undersøgelser af fartøj betændelse i Alzheimers sygdom (AD) og relaterede sygdomme, såsom CAA. Denne metode til isolering af muse koen blev udviklet til vurdering af inflammatoriske cerebrovaskulær genekspression under sygdomsprogression. Sammen med påvisningen af amyloid beta deponering inden væggene af leptomeningeal og pial arterier, kunne denne metode gør det lettere at afskrækkemine det mulige forhold mellem inflammatorisk genekspression i cerebro-kar væg og Ap-peptid akkumulation. Det vaskulære netværk i hjernen, herunder leptomeningeal og pial i subarachnoidealrummet, er en udvidelse af de store arterier danner kredsen af Willis. Den her beskrevne metode kan anvendes til at isolere CoW enhver muse afstamning og kan anvendes til alle typer af screening (fx genekspression, proteinproduktion og posttranslationelle protein modifikationer) på de store fartøjer af muse cerebro-vaskulære gebet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi beskriver her en reproducerbar protokol til isolering af kredsen af Willis. De mest almindelige cerebrovaskulære lidelser, der involverer koen er CAA-associerede vasculopatier, intrakraniel åreforkalkning og intrakranielt aneurisme, som alle påvirker væggene i blodkar. Risikofaktorerne er velkendte, men den molekylære patogenese af disse cerebrale lidelser stadig dårligt forstået og specifikke biologiske markører til at forudsige deres forekomst mangler. Der er stor interesse for metoder til isolering k…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af Paris VI University og en Pierre Fabre Innovation tilskud.
Materials
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Dumont #55 Forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Hardened Fine Iris Scissors | Fine Science Tools | 14090-11 | |
| Scissors – Straight / Sharp / Sharp 16.5 cm | Fine Science Tools | 14002-16 | |
| Dumont #7b Forceps | Fine Science Tools | 11270-20 | |
| Stereoscopic Zoom Microscope | Nikon | SMZ745T | |
| CellBIND Surface 60mm Culture Dish | Corning | #3295 | |
| Peristaltic Pump – MINIPULS 3 | Gilson | M312 | |
| Pentobarbital Sodique | Ceva Santé Animale | FR/V/2770465 3/1992 |
References
- Beckmann, N., et al. Age-dependent cerebrovascular abnormalities and blood flow disturbances in APP23 mice modeling Alzheimer’s disease. J Neurosci. 23 (24), 8453-8459 (2003).
- Sadasivan, C., Fiorella, D. J., Woo, H. H., Lieber, B. B. Physical factors effecting cerebral aneurysm pathophysiology. Ann Biomed Eng. 41 (7), 1347-1365 (2013).
- Ritz, K., Denswil, N., Stam, O., van Lieshout, J., Daemen, M. Cause and mechanisms of intracranial atherosclerosis. Circulation. 130 (16), 1407-1414 (2014).
- Tulamo, R., Frösen, J., Hernesniemi, J., Niemelä, M. Inflammatory changes in the aneurysm wall: a review. J Neurointerv Surg. 2 (2), 120-130 (2009).
- Yamada, M. Cerebral amyloid angiopathy: emerging concepts. J Stroke. 17 (1), 17-30 (2015).
- Oy, B. Intracranial atherosclerotic stroke: specific focus on the metabolic syndrome and inflammation. Curr Atheroscler Rep. 8 (4), 330-336 (2006).
- Lee, H. J., Dietrich, H. H., Han, B. H., Zipfel, G. J. Development of an ex vivo model for the study of cerebrovascular function utilizing isolated mouse olfactory artery. J Korean Neurosurg Soc. 57 (1), 1-5 (2015).
- Hosaka, K., Downes, D. P., Nowicki, K. W., Hoh, B. L. Modified murine intracranial aneurysm model: aneurysm formation and rupture by elastase and hypertension. J Neurointerv Surg. 6 (6), 474-479 (2013).
- Gauthier, S. A., Sahoo, S., Jung, S. S., Levy, E. Murine cerebrovascular cells as a cell culture model for cerebral amyloid angiopathy: isolation of smooth muscle and endothelial cells from mouse brain. Methods Mol Biol. 849, 261-274 (2012).
- Choi, S., Kim, J., Kim, K., Suh, S. Isolation and in vitro culture of vascular endothelial cells from mice. Korean J Physiol Pharmacol. 19 (1), 35-42 (2015).
- Peters, D. G., Kassam, A. B., Yonas, H., O’Hare, E. H., Ferrell, R. E., Brufsky, A. M. Comprehensive transcript analysis in small quantitiesof mRNA by SAGE-Lite. Nucleic Acids Res. 27 (24), (1999).
- Badhwar, A. Stanimirovic, Hamel, & Haqqani The proteome of mouse cerebral arteries. J Cereb Blood Flow Metab. 34 (6), 1033-1046 (2014).
- Castro, L., Brito, M., et al. Striatal neurones have a specific ability to respond to phasic dopamine release. J Physiol. 591 (13), 3197-3214 (2013).
- Hübscher, D., Nikolaev, V. Generation of transgenic mice expressing FRET biosensors. Methods Mol Biol. 1294, 117-129 (2015).
