再生可能バイオ燃料および生化学的生産のための独創的な酵母の遺伝子工学
Summary
We herein report methods on the molecular genetic manipulation of the Yarrowia lipolytica Po1g strain for improved gene deletion efficiency. The resulting engineered Y. lipolytica strains have potential applications in biofuel and biochemical production.
Abstract
ヤロウィアリポリティカは 、非病原性の二形性と厳密に好気性の酵母種です。その独特の生理機能や代謝の特性により、この型破りな酵母は真菌の分化の基本的な性質の研究のための良好なモデルだけではありませんが、また、生化学的生産と大規模な遺伝子操作を必要とする様々な生物工学的適用のための有望な微生物のプラットフォームです。 Y.のが、遺伝子操作リポリティカは 、主KU70遺伝子に起因することができ、効率的かつ安定的な遺伝的形質転換システムの欠如ならびに非相同組換えの非常に高い割合に限定されています。ここでは、効率的な遺伝的形質転換のためにとYにおける遺伝子欠失のための簡単かつ迅速なプロトコルを報告しますリポリティカ Po1g。 Y.への外因性DNAの効率的な形質転換のためにまず、プロトコルリポリティカ Po1gを確立しました。セコndは、標的遺伝子のさらなる削除のために強化された二重交差相同組換え率を達成するために、KU70遺伝子は、1kbの相同性ア ームを担持破壊カセットを形質転換することにより削除されました。第三に、KU70遺伝子の欠失後の増強遺伝子欠失の効果を実証するために、我々は、個別にKU70ノックアウトプラットフォーム株に同じ手順を使用して、アルコールデヒドロゲナーゼおよびアルコールオキシダーゼをコードする11標的遺伝子を削除しました。これは、正確な相同組換えの割合が削除のために0.5％未満の実質的に増加することが観察されました Po1g KU70Δで11標的遺伝子の単一遺伝子欠失のための33％-71％にPo1gでKU70遺伝子の。ハイグロマイシンB耐性マーカーを有する複製プラスミドとのCre / loxPシステムを構築し、酵母ノックアウト株における選択マーカー遺伝子は、最終的にタージェ複数回のを容易にするために、Creリコンビナーゼの発現により除去しましたテッド遺伝子操作。得られた単一遺伝子欠失変異体は、バイオ燃料および生化学的生産において潜在的な用途を有します。
Introduction
サッカロマイセス・セレビシエ 、 ヤロウィアリポリティカ、型にはまらない酵母とは異なり、環境条件1,2の変化に応じて、酵母または菌糸体の形で成長することができます。したがって、この二形酵母は真菌の分化、形態形成および分類3,4,5の研究のための良いモデルとして使用することができます。一般に広く、有機酸、ポリアルコール、芳香化合物、乳化剤及び界面活性剤-6,7,8,9-などの食品添加物の多様を生成するために使用される安全な（GRAS）酵母種とし て見なされます。これは絶対好気性自然細胞乾燥重量10の70％まで、多量、 すなわちに脂質を蓄積することができる周知の油性酵母です。また、栄養素11,12,13として廃資源における残基の異なる種類を含む、成長のための炭素源の広いスペクトルを利用することができます。これらのユニークな機能のすべてがYを作ります以下のための非常に魅力的リポリティカ様々なバイオテクノロジー用途。
Yの全ゲノム配列が、 リポリティカが 14,15を公開されている、この型破りな酵母の遺伝子操作は、他の酵母種よりも複雑です。まず、この酵母種の変換は、それほど効率的により安定的かつ効率的な形質転換系16,17が存在しないことです。全く自然なエピソームプラスミドシステムは、この酵母18で発見されていないように、第2の線形発現カセットの面倒なゲノム組み込みは、一般に、目的の遺伝子の発現のために使用されます。この酵母で正確な相同組換えを介して効率遺伝子ターゲッティングが低く、ほとんどの統合イベントは非相同末端結合（NHEJ）19を介して発生するため、遺伝的ノックアウトおよびノックインの第三に、世代が制限されています。
本研究では、Yのための最適化された形質転換プロトコルを報告しますリポリティカ </em>の、簡単迅速、効率的かつ再現性のあるPo1g株。正確な相同組換えの頻度を高めるために、我々は、NHEJ経路における重要な酵素をコードするKU70遺伝子を削除しました。最適化された形質転換プロトコルを用いて、1キロバイト、Y.のKU70遺伝子のフランキング相同領域を含む直鎖ノックアウトカセットを形質転換することによってリポリティカ Po1gは正常に削除されました。この遺伝子の欠失方法のロバスト性は、その後Po1g KU70Δ株において、アルコールデヒドロゲナーゼ及びアルコールオキシダーゼ遺伝子を標的にすることによって実証されました。これは、KU70欠損株は、野生型Po1g株よりも標的相同組換えを介した遺伝子のかなり高い効率を示すことが観察されました。また、ハイグロマイシンB耐性マーカーを保有する複製Cre発現プラスミドは、マーカーレスキューを実行するように構築しました。マーカーレスキューは番目に遺伝子標的の複数のラウンドを容易にEは、遺伝子欠失突然変異体を得ました。遺伝子欠失に加えて、ここに記載の遺伝的形質転換および遺伝子欠失のための我々のプロトコルは、特定の遺伝子座に遺伝子を挿入するために適用することができ、およびY.に部位特異的変異を導入することリポリティカゲノム 。
Protocol
Representative Results
Discussion
この研究のための私たちの目標は、Yに標的遺伝子ノックアウトの迅速かつ効率的な生成を可能にすることですPo1g株リポリティカ 。いくつかの考慮事項は、これを達成するために対処する必要があります。まず、高変換効率が必要です。したがって、Y.ための効率的で便利な化学的形質転換プロトコルリポリティカ Po1g株を本研究に記載されました。 PEG-4000を…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私たちは感謝シンガポール（ETRP 1201102）の国家環境庁からの資金援助を認める、シンガポール国立研究財団（NRF-CRP5-2009-03）、シンガポールの科学技術研究庁の競争研究プログラム（ 1324004108）、グローバルR＆Dプロジェクトの計画、知識経済部、大韓民国（N0000677）、国防脅威削減局（DTRA、HDTRA1-13-1-0037）と合成生物学シンガポール国立大学のイニシアティブ（ DPRT / 943/9月14日）。
Materials
| Reagent/Material | |||
| Oligonucleotide primers | Integrated DNA Technologies | 25 nmole DNA oligos | |
| Y. lipolytica strain Po1g | Yeastern Biotech | leucine auxotrophic derivative of the wild-type strain W29 (ATCC 20460) | |
| Vector pYLEX1 | Yeastern Biotech | FYY203-5MG | Y. lipolytica expression vector |
| E. coli TOP10 | Invitrogen | For cloning and propagation of plasmids | |
| pGEM-T vector | Promega | A3600 | TA cloning vector |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | For plasmid isolation |
| Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System |
Promega | A9282 | Extract DNA fragments from agarose gels and purify PCR products from an amplification reaction |
| The iProof high-fidelity DNA polymerase |
Bio-Rad | 172-5302 | High-fidelity DNA polymerase |
| BamHI | New England Biolabs | R0136S | Restriction enzyme |
| BglII | New England Biolabs | R0144L | Restriction enzyme |
| KpnI | New England Biolabs | R0142S | Restriction enzyme |
| NdeI | New England Biolabs | R0111S | Restriction enzyme |
| NotI | New England Biolabs | R0189L | Restriction enzyme |
| PmlI | New England Biolabs | R0532S | Restriction enzyme |
| PstI | New England Biolabs | R0140S | Restriction enzyme |
| SacII | New England Biolabs | R0157S | Restriction enzyme |
| SalI | New England Biolabs | R0138S | Restriction enzyme |
| XhoI | New England Biolabs | R0146L | Restriction enzyme |
| T4 DNA ligase | New England Biolabs | M0202L | |
| Taq DNA polymerase | Bio-Rad | M0267L | |
| Ampicillin | Gibco-Life Technologies | 11593-027 | Antibiotics |
| Hygromycin B | PAA | P21-014 | Antibiotics |
| GeneRuler 1 kb DNA ladder | Thermo Scientific | SM0312 | 1 kb DNA ladder |
| PEG4000 | Sigma | 95904-F | |
| Tris | Promega | H5135 | |
| EDTA | Bio-Rad | 161-0729 | |
| Salmon Sperm DNA | Invitrogen | 15-632-011 | |
| Lithium Acetate | Sigma | ||
| Acetic acid | Sigma | ||
| Glass beads (425-600 µm) | Sigma | G8772 | |
| RNAse A | Thermo Scientific | EN0531 | |
| DNA Loading Dye | Thermo Scientific | R0611 | |
| Bacto Yeast Extract | BD | 212750 | |
| Bacto Peptone | BD | 211677 | |
| D-Glucose | 1st Base | BIO-1101 | |
| YNB without amino acids | Sigma | Y0626 | |
| DO Supplement-Leu | Clontech | 630414 | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | |
| Difco LB Broth | BD | 244620 | |
| Difco LB Agar | BD | 244520 | |
| Bacto Agar | BD | 214010 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| PCR machine | Biorad | T100 Thermal Cycler | |
| Water bath | Memmert | WNB 14 | |
| Stationary/Shaking Incubator | Yihder | LM-570RD | |
| Thermo-shaker | Allsheng | MS-100 | |
| Micro centrifuge | Eppendorf | 5424R | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Spectrophotometer | Eppendorf | BioPhotometer plus | |
| Gel imager | GE | Amersham Imager 600 | |
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