Ферментативная активность лактазы имеет важное значение для катаболических обработки дисахарид лактоза. Здесь активность лактазы в биологически активных добавок является анализ с использованием колориметрического анализа. Это обеспечивает студентов экспериментальной площадкой для понимания активность лактазы и фермента кинетики.
Понимание принципа работы ферментов и это, касающимся примеров из реальной жизни, имеет решающее значение для широкий спектр бакалавра в биомедицинских и биологических науках. Это легко следовать протокол был разработан для студентов первого курса бакалавра фармации и введение начального уровня ферментативных реакций и аналитических процедур для анализа фермента. Фермент выбора является лактазы, поскольку это представляет собой пример коммерчески доступных фермента, имеющих отношение к человеческой болезни/фармацевтическая практика. Лактаза добывается из таблетки добавка и оценить с помощью колориметрических пробирного, основанные на гидролиз искусственным субстратом для лактазы (Орто-нитрофенола –бета-D-галактопиранозид, ONPG). Релиз Орто нитрофенола после гидролитического расщепления ONPG лактазы измеряется изменения поглощения на 420 Нм и влияние температуры на ферментативной реакции оценивается путем проведения реакции на льду, при комнатной температуре и 37 ° C. Более сложный анализ может осуществляться с помощью этого протокола, оценки активность фермента в различных условиях и с использованием различных реагентов.
Ферменты представляют собой особый тип протеина, которые действуют как биологические катализаторы химических реакций в живых организмов1. Действие ферментов имеет решающее значение для жизни, обеспечение энергии, утилизации отходов и позволяя организмов функционировать. Таким образом, понимание ферментов имеет решающее значение для полного понимания жизни. Такие знания имеет важное значение для широкого ряда университета степень программы, начиная от медицинских наук в биологии. Хотя подробный справочный, начиная от принципов катализа теоретические модели ферментативной активности могут быть предоставлены студентов с помощью лекций и материалов для чтения, свойства ферментативных реакций лучше осмыслить руки на практическом опыте ферменты в действии, ранее продемонстрировал2. Этот протокол обеспечивает простой следовать экспериментальная парадигма для измерения активности ферментов в лабораторных условиях, с использованием лактазы в качестве примера содержит фермент с активностью, касающимся питания и здоровья людей.
Гликозидная гидролазы лактаза (EC 3.2.1.23/26) — фермент питания важное для млекопитающих3. Активность лактазы высоко сохраняется путем эволюции и вытекает из бета галактозидазы семейства ферментов — семейство подарок от Escherichia coli через Homo sapiens (рис. 1, PDB 1JZ8)4. Решающее значение лактазы в условиях человеческого питания проистекает из ее роли в разрешении разбивка лактозы в его учредительные моносахаридов компоненты, которые затем могут быть использованы для получения энергии в организме. Лактаза катализирует гидролиз гликозидные связи в дисахарид лактоза, выпустив галактозы и глюкозы (рис. 2)5. Затем эти моносахаридов используются главным образом для производства аденозинтрифосфата (АТФ) через цикл лимонной кислоты и окислительного фосфорилирования6. В ходе новорожденным и детского развития лактаза высоко выражается в человеческой пищеварительной системы, разрушения лактозы, полученных от грудного молока, из которых лактоза является основным углеводный компонент и один из ключевых источников питания в первые годы 7. медицинское значение лактазы выделена врожденной лактозной недостаточности (ХЗЛ), редкое аутосомно-рецессивный состояния, вызванные мутации в гене лактаза (LCT), кодирования для фермента лактазы8. Новорожденных с ХПЛ exhibit очень мало активности лактазы, таким образом они не кормили грудным молоком, любые другие виды молока, или формула, содержащая лактозу.
В детстве лактаза выражение обычно уменьшается; Однако это сокращение после отъема географически, меняется с приблизительно 35% взрослых во всем мире продолжает выражать фермента9. Устойчивое выражение лактазы, известный как сохранение лактазы, позволяет людям продолжать переваривать молока и молочных продуктов из целого ряда источников. И наоборот потеря лактазы выражения может привести к непереносимости лактозы, также известный как взрослый типа hypolactasia (ATH), обусловленных невозможностью сломать лактозы в кишечнике. ATH характеризуется построения вверх лактозы в толстой кишке после проглатывания лактозы, содержащих продуктов питания. В толстой кишке накопленные лактозы сбраживается в кишечнике микроорганизмов фауны, выпуска газов, включая водород, метан и двуокись углерода. Производство этих газов в отдельных лиц с недостатками фермента лактазы содействовать вздутие живота, увеличение метеоризм, боли, тошнота и borborygmi (урчание желудка)7. Повышение уровня лактозы в ЖКТ может также привести к жидкий стул.
Контроля за экспрессией генов LCT модулируется полиморфизмы расположен в интронов близлежащих гена MCM6 . Лица с устойчивой выражением лактазы нести полиморфизмы, которые функционируют как сильный дистальной расширители для LCT экспрессии генов, таким образом компенсируя нормальный вниз регуляции транскрипции LCT при отлучке и, следовательно, поддержания лактазы выражение в зрелом возрасте3. Полиморфизмы усилитель было предложено положительно выбраны после приручения крупного рогатого скота и верблюдов на Ближнем Востоке более пяти тысяч лет назад9,10.
Симптомы, обусловленные ATH можно управлять путем сокращения потребления лактозы, например путем удаления молочные продукты из рациона. Альтернативный подход для ATH и метод выбора для ХЗЛ, является использование добавок лактазы, широко доступны в аптеках. Эти добавки обеспечивают лактазы, изолированных из различных источников, в том числе дрожжей и бактерий, в жидкости или таблетки на основе формы, которые могут быть приняты с или добавлены к лактозы, содержащих продуктов питания. Доплата будет гидролизуют доля лактозы, присутствующих в пище глюкозы и галактозы продуктов, таким образом позволяя их поглощения и предотвращения накопления непереваренной лактозы субстрата в кишечнике.
На основе использования лактазы добавки в качестве диетического средства, мы разработали простой энзимологии лабораторный эксперимент подходит для студентов первого курса биомедицинской науки или аптека. Данный лабораторный эксперимент использует коммерчески доступных лактазы добавки и использует Орто-нитрофенола –бета-D-галактопиранозид (ONPG) предоставлять колориметрические конечной точкой для измерения расщепления гликозидных связей лактаза ( Рисунок 3)11. Действует ONPG искусственных субстрат для лактазы, который когда подвергается гидролизу, этот фермент производит D-галактоза и орто нитрофенола. Последний продукт имеет желтый цвет, поглощая свет на длине волны 420 Нм. Путем определения количественных показателей изменения поглощения на 420 Нм следующее воздействие ONPG лактазы, это можно оценить активность этого фермента. Данный лабораторный эксперимент предоставляет демонстрацию гидролазы ферментативной активности. Здание в дополнительных реплицирует и проведения анализов в разных условиях, это возможно для включения более сложных анализов Ферментативная кинетика, обеспечивая ценным примером реальной жизни ферментов в действии, имеющих отношение к здоровью человека.
Для широкого круга вопросов, охватывающих биология, биомедицина и фармакологии требуется детальное знание и понимание ферментов, ферментативных реакций и Ферментативная кинетика. Протокол, описанные выше использует лактазы в качестве примера отношение к здоровью человека фермента для демонстрации ферментативных реакций, предоставляя ключевые навыки, которые могут быть использованы в более сложных лабораторных экспериментов.
Этот протокол был разработан преднамеренно быть столь надежным, как возможно, позволяя студентам с мало или вообще не мокрые лаборатории опытом интерпретации результатов в короткий промежуток времени. 2014/2015 учебном году в школе университета Ридинга фармации в общей сложности 144 студентов, организованные в группы из 3, провели эксперимент «измерения лактазы», со всеми группами удалось обнаружить некоторые уровня ферментативной активности лактазы таблетки экстракты.
Существует целый ряд важных шагов в этом протоколе. Во-первых важно, что первоначальное извлечение является эффективным, позволяя солюбилизация достаточно активный фермент для последующего анализа. Наш опыт показывает первый год студенты могут добиться этого, следуя протоколу как указано; Однако некоторые указания от лаборатории демонстрантов требовалось на данный момент. Хотя казалось бы точку самоочевидным, ключевым фактором в обеспечении успеха этого протокола является способность тщательно измерить томов, правильно этикетке трубки и следуйте инструкциям. Хотя можно предположить определенный уровень владения языком, для многих студентов, тщательный мониторинг и четкий запрос для студентов попросить помощи в том случае, если они не уверены что делать далее обеспечивает наибольшую вероятность успешного анализа.
Оценки студентов может осуществляться в классе листа (в качестве дополнительного материала), просим студентов обратить внимание на данные из экспериментов, комментировать их результаты и ссылку Справочная информация/чтения от материал лекции, или больше подробные, из класса оценки с модель данных позволяет для кинетического анализа попытка и оцениваться.
Протокол, представленные в настоящем документе приведен простой пример анализа активности лактазы под обучение лабораторных условиях, и есть широкие возможности для повышения сложности эксперимента разрешить дополнительные анализы. В частности представленные протокол представляет собой введение в концепции Ферментативная кинетика, но не позволяют для кинетического анализа экспериментальных данных. Таким образом мы рекомендовали бы Просмотр протокола описаны как первоначального шаблона для классов, с точные детали, адаптировать с учетом конкретных целей и таланты когорте студентов, проводит эксперименты. Примеры расширенных экспериментов могут включать: повторил измерений при различных температурах, используя различные субстрата концентрации для статистического анализа, кинетический анализ данных (подходит для биохимии студентов/майоров), начиная с несколько различных таблеток и позволяет студентам оценивать различные активность фермента в каждом (с добавлением управления таблетки, подходит для студентов/майоров судебно-медицинской науки), оценки воздействия тепловой денатурации или проведение конкурса эксперименты с добавлением лактозы или ингибиторов лактазы (Таблица 1). Подробный протокол для кинетического анализа лактазы ранее были опубликованы12.
Важным преимуществом этого протокола является, что он сочетает в себе основные введение в энзимологии и фермента кинетики реальной жизни тематическое исследование энзимологии в медицине. Это делает этой лаборатории эксперимента особое значение для студентов медицины, фармации, биомедицинских наук и связанным с ними вопросам. Важно отметить, что тот факт, что существует серьезное заболевание и более широко диетических проблема, связанная с лактозы катаболизма обеспечивает возможность поднять широкий спектр медицинских и этических проблем со студентами. Это может включать вопросы, касающиеся генетического тестирования для медицинских условий и связанные обсуждения, связанные с генной терапии и генетическое консультирование, а также использование и продажу лекарственных добавок. Одним из основных ограничений является, что протокол не позволяет для точной оценки концентрации фермента, из-за исходный материал, используемый для извлечения. Изменения для учета этого, однако, будет использовать фермент класса реагент для assay. Главное это также позволит более точный расчет кинетики для фермента лактазы.
В заключение, опробование активность лактазы в лаборатории обучения среда обеспечивает надежный, привлекательные и интересные введение в области биологии фермента для ранней стадии студентов университета.
The authors have nothing to disclose.
PAL финансировался Паркинсона Великобритании исследовательских стипендий (Грант F1002). Эта работа была поддержана MRC новый следователь исследовательский грант (MR/L010933/1) и программой MRC Грант MR/N026004/1, PAL и СИББН студенчества BB/M017222/1-JET. Мы благодарим когорты 2014-15 MPharm часть 1 студентов в университете чтения для участия в первой итерации этого практические и последующей когорты их обратной связи и ввода.
Lactase tablet | Lamberts | 8511-60 | |
Phosphate buffered saline (powdered) | Sigma | P3813 | Dissolved in deionized water to a final concentration of 100 mM |
ONPG | Sigma | N1127 | Dissolved in deionized water to a final concentration of 5 mM |
Sodium Carbonate | Sigma | 451614 | Dissolved in deionized water to a final concentration of 1 M |
De-ionized water | NA | NA | |
Pestle and mortar | VWR | ||
Spectrophotometer | Jenway 6315 | ||
Pipettes | Gilson | ||
15 mL tubes | VWR | ||
1.5 mL tubes | Eppendorf | ||
Spectrophotometer cuvettes | Jenway | ||
Vortex | Vortex genie 2 | ||
Centrifuge | Beckman | ||
Ice bucket | VWR | ||
Water bath | Thermo-Scientific | ||
Weighing scales | Thermo-Scientific |