Очистка Native Комплексы для структурного исследования с использованием метода Tag Тандем Affinity
Summary
The Tandem Affinity Purification (TAP) method has been used extensively to isolate native complexes from cellular extract, primarily eukaryotic, for proteomics. Here, we present a TAP method protocol optimized for purification of native complexes for structural studies.
Abstract
Affinity подходы очистки были успешными в выделении родных комплексов для протеомики характеристик. Структурная неоднородность и степень композиционной неоднородности комплекса обычно не препятствуют прогрессу в проведении таких исследований. В отличие от этого, комплекс, предназначенный для структурной характеристики должны быть очищены в состоянии, которое является как композиционно и структурно однородными, а также при более высокой концентрации, чем требуется для протеомики. В последнее время были достигнуты значительные успехи в области применения электронной микроскопии для определения структуры крупных макромолекулярных комплексов. Это повысило интерес к подходам, чтобы очистить собственные комплексы достаточного количества и качества для структурного определения с помощью электронной микроскопии. Метод Tandem Affinity очистки (TAP) была оптимизирована для извлечения и очистки 18-субъединицу, ~ 0,8 МДа рибонуклеопротеиновый сборка из почкующихся дрожжей (Saccharomyces CEREVISIAE) </EM> подходит для отрицательного пятна и электронной микроскопии крио. При этом подробно изменения, внесенные в метод TAP, обоснование внесения этих изменений, и подходы, используемые для анализа на композиционно и структурно однородного комплекса.
Introduction
Многие крупные клеточные процессы осуществляются крупные белковые и белково-РНК комплексов 1. Существенным препятствием для проведения биофизических и структурных исследований таких комплексов их получения подходящего качества (то есть, однородности) и при соответствующей концентрации. Разделительный комплекс из природного источника имеет много преимуществ, в том числе сохранение соответствующих пост-транскрипционные и / или трансляционные модификации субъединиц и надлежащего страхования сложной сборки. Тем не менее, крупные клеточные комплексы часто присутствуют в клетке при низком числе копий, и очистку должны быть высокоэффективным и происходят в условиях, близких физиологических условиях для обеспечения сложной целостность сохраняется. Очищающий комплекс из эукариотической источника является особенно сложным и может быть финансово запретительной. Таким образом, стратегии или методы, которые являются эффективными и дают однородный комплекс являются весьма желательны.
Стратегия, которая былауспешно очистки родных комплексов из эукариотических клеток для их первоначальной характеристике является метод Tandem Affinity очистки (TAP) 2,3. Метод TAP был первоначально разработан для очистки нативного белка из почкующихся дрожжей (S. CEREVISIAE) в комплексе с взаимодействующими фактор (ы) 2. Метод ТАР используются две метки, каждый тэг, слитый в тандеме с той же кодирующей белок последовательности гена. Теги были выбраны таким образом, чтобы сбалансировать потребность в жесткой и селективное связывание с аффинным смолой с желанием поддерживать почти физиологических условиях в растворе. Этот баланс служит для сохранения устойчивого взаимодействия (ов) меченого белка с взаимодействующими фактора (ов) для определения характеристик после очистки. Genomically включены ТАР тег был помещен в конце (С-концевой) гена кодирующей белок и состоит из последовательности, кодирующей кальмодулин связывающий пептид (CBP), а затем белок А – добавление чуть более 20 кДа, к помеченным белок. CBP короткая, 26 аминокислот, и распознаваться ~ 17 кДа белок Кальмодулин (САМ) в присутствии кальция с K D порядка 10 -9 М 4. Белок Тег больше, состоящий из двух повторах 58 остатков с коротким линкером между повторами. Каждый повтор 58 аминокислоты признается иммуноглобулина G (IgG) с K D ~ 10 -8 М 5. Между этими двумя тегами был включен сайт узнавания для TEV протеазы, эндопептидазы из вируса табачной Etch 6,7. Как показано на фиг.1, на первой стадии аффинной метода ПВР меченый белок связывается с IgG смолы с помощью Протеин А. меченый белок элюируют на колонке с расщеплением при добавлении TEV протеазы, сайт-специфически отщеплением между две метки. Это является необходимым шагом, как взаимодействие IgG и белок А является очень сильным и может быть адекватно возмущенных только в денатурирующих условиях решения. Не имея Protein теге, белок связывается с СаМ смолой в присутствии кальция и элюируют из смолы с добавлением металлического иона хелатор EGTA (этиленгликоль этилендиаминтетрауксусной кислоты) (рисунок 1).
Вскоре после того, как введение метода TAP, он был использован в крупномасштабном исследовании , чтобы сгенерировать "карту" сложных взаимодействий в S. CEREVISIAE 8. Важно отметить, что в результате этих усилий библиотека все дрожжи-TAP Tagged открытой рамки считывания (ORF), а также индивидуальной TAP помеченный ORF , 9 доступны из коммерческих источников. Таким образом, можно получить любой штамм дрожжей с меченый белок для любого дрожжевого комплекса. Метод TAP также стимулировало модификации или вариации TAP тега, в том числе: ее использование для очистки комплексов из других эукариотических, а также бактериальных клеток 10,11; дизайн "Половину метки", в котором белок А и ТПС размещаются на различных белков 12; и таГ.С. изменена, с тем, чтобы удовлетворить потребность исследователя, такие как чувствительность комплекса к Са 2+ или EGTA 13.
Последние достижения в области как инструментария и методологии привели к значительному прогрессу в области применения электронной микроскопии (ЭМ) для определения структуры, которые привели к высоким, близким к изображениям с атомарным разрешением макромолекулярных комплексов 14. Разрешение можно получить из комплекса Е.М., однако, по-прежнему зависит от качества комплекса при исследовании. Это исследование использовало подход TAP тег , чтобы очистить от S. CEREVISIAE и1 snRNP, 18-субъединица (~ 0,8 МДА) с низким числом копий рибонуклеопротеиновый комплекс , который является частью сплайсосома 15,16. Ряд шагов были приняты, чтобы очистить этот комплекс таким образом, что она однородна и адекватной концентрации. Потенциальные проблемы, возникающие на различных стадиях очистки описаны и стратегии, направленные на преодоление Challenges выделены. Путем тщательной оценки и оптимизации шаги в очистке, то U1 snRNP очищают имеет качество и в количестве, подходящем для отрицательного пятна и электронной микроскопии (крио крио-ЭМ) исследований. Оптимизированный ТАР протокол метод очистки нативных комплексов для структурных исследований описан здесь.
Protocol
Representative Results
Discussion
Метод TAP использует две метки, которые балансируют потребность в жесткой и селективное связывание с аффинной смолой с желанием поддерживать почти физиологических условиях раствора. Этот баланс служит для сохранения устойчивого взаимодействия (ов) меченого белка с взаимодействующими…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors are grateful for the support and advice of Nikolaus Grigorieff. We thank Anna Loveland, Axel Brilot, Chen Xu, and Mike Rigney for helpful discussions and EM guidance. This work was funded by the National Science Foundation, Award No. 1157892. The Brandeis EM facility is supported by National Institutes of Health grant P01 GM62580.
Materials
| S. cerevisiae TAP tagged strain | Open Biosystems | YSC1177 | This is the primary yeast strain used to develop the TAP protocol. Its background is S288C: ATCC 201388: MATa, his3Δ1, leu2Δ0, met15Δ0, ura3Δ0, SNU71::TAP::HIS3MX6 |
| Coffee grinder | Mr. Coffee | IDS77 | Used for cell lysis |
| Hemocytometer, Bright Line | Hausser Scientific | 3120 | Used to assess cell lysis |
| JA 9.100 centrifuge rotor | Beckman Coulter, Inc. | Used to harvest the yeast cells | |
| JA 20 fixed-angle centrifuge rotor | Beckman Coulter, Inc. | Used to clear the cell extract of non-soluble cellular material | |
| Ti 60 fixed-angle centrifuge rotor | Beckman Coulter, Inc. | Used to further clear the soluble cell extract | |
| Thermomixer | Eppendorf | R5355 | Temperature controlled shaker |
| Novex gel system | Thermo Fisher Scientific | ||
| IgG resin | GE Healthcare | 17-0969-01 | Sepharose 6 fast flow |
| Calmodulin resin | Agilent Technologies, Inc. | 214303 | Affinity resin |
| Protease inhibitor cocktail, mini tablets | Sigma Aldrich | 589297 | Mini cOmplete ultra EDTA-free tablets |
| Protease inhibitor cocktail, large tablets | Sigma Aldrich | 5892953 | cOmplete ultra EDTA-free tablets |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | Dissolved in isopropanol | ||
| 2 mL Bio-spin column | Bio-Rad Laboratories, Inc. | 7326008 | Used to pack and wash the Calmodulin resin |
| 10 mL poly-prep column | Bio-Rad Laboratories, Inc. | 7311550 | Used to pack and wash the IgG resin |
| Precast native PAGE Bis-Tris gels | Life Technologies | BN1002 | Novex NativePAGE Bis-Tris 4-16% precast polyacrylamide gels |
| NativeMark protein standard | Thermo Fisher Scientific | LC0725 | Unstained protein standard used for native PAGE. Load 7.5 μL for a silver stained gel and 5 μL for a SYPRO Ruby stained gel |
| Precast SDS PAGE Bis-Tris gels | Life Technologies | NP0321 | Novex Nu-PAGE Bis-Tris 4-12% precast polyacrylamide gels |
| PageRuler protein standard | Thermo Fisher Scientific | 26614 | Unstained protein standard used for Western blotting |
| SDS running buffer | Life Technologies | NP0001 | 1x NuPAGE MOPS SDS Buffer |
| TAP antibody | Thermo Fisher Scientific | CAB1001 | Primary antibody against CBP tag |
| Secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | 31341 | Goat anti-rabbit alkaline phosphatase conjugated |
| BCIP/NBT | Thermo Fisher Scientific | 34042 | 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate/nitro blue tetrazolium |
| Dialaysis units | Thermo Fisher Scientific | 88401 | Slide-A-Lyzer mini dialysis units |
| Centrifugal filter units, 100kDa MWCO | EMD Millipore | UFC5100008 | Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-100 membrane |
| Detergent absorbing beads | Bio-Rad Laboratories, Inc. | 1523920 | Bio-bead SM-2 absorbants |
| SYBR Green II | Thermo Fisher Scientific | S-7564 | Flourescent dye for nucleic acid staining, when detecting with SYPRO Ruby present, use excitation wavelength of 488 nm and emission wavelength of 532 nm |
| SYPRO Ruby | Molecular Probes | S-12000 | Flourescent dye for protein staining, when detecting with SYBR Green II present, use excitation wavelength of 457 nm and emission wavelength of 670 nm |
| Copper grids | Electron Microscopy Sciences | G400-CP |
References
- Gavin, A. C., et al. Functional organization of the yeast proteome by systematic analysis of protein complexes. Nature. 415 (6868), 141-147 (2002).
- Rigaut, G., Shevchenko, A., Rutz, B., Wilm, M., Mann, M., Seraphin, B. A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration. Nature Biotechnology. 17 (10), 1030-1032 (1999).
- Puig, O., et al. The tandem affinity purification (TAP) method: A general procedure of protein complex purification. Methods. 24 (3), 218-229 (2001).
- Vaillancourt, P., Zheng, C. F., Hoang, D. Q., Breister, L. Affinity purification of recombinant proteins fused to calmodulin or to calmodulin-binding peptides. Methods Enzymol. 326, 340-362 (2000).
- Braisted, A. C., Wells, J. A. Minimizing a binding domain from protein A. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (12), 5688-5692 (1996).
- Kapust, R. B., et al. Tobacco etch virus protease: mechanism of autolysis and rational design of stable mutants with wild-type catalytic proficiency. Protein Eng. 14 (12), 993-1000 (2001).
- Nallamsetty, S., et al. Efficient site-specific processing of fusion proteins by tobacco vein mottling virus protease in vivo and in vitro. Protein Expr Purif. 38 (1), 108-115 (2004).
- Ghaemmaghami, S., et al. Global analysis of protein expression in yeast. Nature. 425 (6959), 737-741 (2003).
- Howson, R., et al. Construction, verification and experimental use of two epitope-tagged collections of budding yeast strains. Comp Funct Genomics. 6 (1-2), 2-16 (2005).
- Cox, D. M., Du, M., Guo, X., Siu, K. W., McDermott, J. C. Tandem affinity purification of protein complexes from mammalian cells. Biotechniques. 33 (2), 267-268 (2002).
- Gully, D., Moinier, D., Loiseau, L., Bouveret, E. New partners of acyl carrier protein detected in Escherichia coli by tandem affinity purification. FEBS Lett. 548 (1-3), 90-96 (2003).
- Tharun, S. Purification and analysis of the decapping activator Lsm1p-7p-Pat1p complex from yeast. Methods Enzymol. 448, 41-55 (2008).
- Xu, X., Song, Y., Li, Y., Chang, J., Zhang, H., An, L. The tandem affinity purification method: an efficient system for protein complex purification and protein interaction identification. Protein Expr Purif. 72 (2), 149-156 (2010).
- Cheng, Y., Grigorieff, N., Penczek, P. A., Walz, T. A Primer to Single-Particle Cryo-Electron Microscopy. Cell. 161 (3), 438-449 (2015).
- Gottschalk, A., et al. A comprehensive biochemical and genetic analysis of the yeast U1 snRNP reveals five novel proteins. RNA. 4 (4), 374-393 (1998).
- Neubauer, G., Gottschalk, A., Fabrizio, P., Seraphin, B., Luhrmann, R., Mann, M. Identification of the proteins of the yeast U1 small nuclear ribonucleoprotein complex by mass spectrometry. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (2), 385-390 (1997).
- Lucast, L. J., Batey, R. T., Doudna, J. A. Large-scale purification of a stable form of recombinant tobacco etch virus protease. Biotechniques. 30 (3), 544-546 (2001).
