Purification de Native Complexes pour l'étude structurale utilisant une méthode de Tag Tandem Affinity
Summary
The Tandem Affinity Purification (TAP) method has been used extensively to isolate native complexes from cellular extract, primarily eukaryotic, for proteomics. Here, we present a TAP method protocol optimized for purification of native complexes for structural studies.
Abstract
approches de purification d'affinité ont réussi à isoler des complexes indigènes pour la caractérisation protéomique. hétérogénéité structurelle et un degré d'hétérogénéité de la composition d'un complexe ne gênent généralement pas les progrès accomplis dans la réalisation de telles études. En revanche, un complexe destiné à la caractérisation structurale doit être purifié dans un état qui est à la fois de composition et de structure homogène ainsi qu'à une concentration plus élevée que celle requise pour la protéomique. Récemment, il y a eu des avancées significatives dans l'application de la microscopie électronique pour la détermination de structure de grands complexes macromoléculaires. Cela a accru l'intérêt dans les approches pour purifier des complexes indigènes de qualité et en quantité suffisante pour la détermination structurale par microscopie électronique. La méthode Tandem Affinity Purification (TAP) a été optimisé pour extraire et purifier une 18 sous-unité, ~ 0,8 MDa ribonucléoprotéine ensemble de levure bourgeonnante (Saccharomyces cerevisiae) </em> approprié pour coloration négative et la microscopie cryo électronique. Ici est détaillée les modifications apportées à la méthode TAP, la justification de ces changements, et les approches adoptées pour doser un complexe de composition et de structure homogène.
Introduction
De nombreux processus cellulaires majeurs sont réalisées par grandes protéines et protéines complexes ARN-1. Un goulot d' étranglement important pour la réalisation d' études biophysiques et structurelles de ces complexes est leur obtention d'une qualité appropriée (c. -à- homogénéité) et à une concentration appropriée. Isoler un complexe à partir d'une source naturelle présente de nombreux avantages, notamment en conservant les modifications post-transcriptionnel et / ou traductionnelles pertinentes des sous-unités et assurer l'assemblage complexe approprié. Cependant, de grands complexes cellulaires sont souvent présents dans une cellule à un faible nombre de copies et la purification doivent être hautement efficace et se produire dans des conditions physiologiques proches pour assurer l'intégrité complexe est maintenue. Purifier un complexe d'une source eucaryote est particulièrement difficile et peut être financièrement prohibitif. Ainsi, les stratégies ou les méthodes qui sont efficaces et donnent un complexe homogène sont très recherchés.
Une stratégie qui a étésuccès dans la purification des complexes natifs à partir de cellules eucaryotes pour leur caractérisation initiale est la méthode Tandem Affinity Purification (TAP) 2,3. La méthode TAP a été initialement conçu pour purifier une protéine native de la levure bourgeonnante (S. cerevisiae) dans un complexe avec l' interaction facteur (s) 2. Le procédé utilisé TAP deux étiquettes, chaque étiquette fusionnée en tandem à la même séquence de gène codant pour la protéine. Les étiquettes ont été choisies de manière à équilibrer le besoin pour une liaison étanche et sélective sur une résine d'affinité avec un désir de maintenir des conditions proches de la solution physiologique. Cet équilibre permet de préserver l'interaction stable (s) de la protéine marquée avec l'interaction facteur (s) pour la post-purification de caractérisation. L'étiquette TAP génomiquement intégré est placé à l'extrémité (C-terminale) d'un gène codant pour une protéine et est composée d'une séquence codant pour un calmoduline de liaison du peptide (PFC), suivie par la protéine A – une addition d'un peu plus de 20 kDa à la tagged protéine. CBP est courte, 26 acides aminés, et reconnues par la protéine de 17 kDa ~ calmoduline (CaM) , en présence de calcium avec un Kd de l'ordre de 10 -9 M 4. La balise protéine A est plus grand, composé de deux répétitions de 58 résidus avec un court lieur entre les répétitions. Chaque répétition d'acides aminés 58 est reconnu par l' immunoglobuline G (IgG) avec un Kd ~ 10 ~ 8 M 5. Entre ces deux balises a été incorporé un site de reconnaissance pour la protéase TEV, une endopeptidase du virus Tobacco Etch 6,7. Comme cela est illustré sur la figure 1, dans la première étape d'affinité du procédé TAP protéine marquée est liée à une résine d' IgG via la protéine A. La protéine marquée est éluée par sur une colonne de clivage lors de l'addition de la protéase TEV, spécifique au site de clivage entre les deux balises. Ceci est une étape nécessaire que l'interaction de l'IgG et la protéine A est très forte et ne peut être perturbée de manière adéquate sous des conditions de dénaturation de la solution. Faute d'un PrUne étiquette otein, la protéine est liée à la résine CaM en présence de calcium et on l' élue de cette résine avec addition de l'EGTA chélateur d'ions métalliques (éthylène glycol d'acide tétra – acétique) (figure 1).
Peu après l'introduction de la méthode TAP, il a été utilisé dans une étude à grande échelle pour générer une «carte» des interactions complexes dans S. 8 cerevisiae. Il est important, comme une conséquence de cet effort tout un cadre de levure TAP Tagged lecture ouvert (ORF) bibliothèque ainsi que TAP individuels marqués ORFs 9 sont disponibles à partir d' une source commerciale. Ainsi, on peut obtenir toute souche de levure avec une protéine étiquetée pour chaque complexe de levure. La méthode TAP a également stimulé des modifications ou des variations de la balise TAP, y compris: son utilisation pour la purification des complexes provenant d' autres eucaryotes, ainsi que des cellules bactériennes 10,11; la conception d'un "tag diviser", dans lequel la protéine A et CBP sont placés sur différentes protéines 12; et tags changés, de manière à tenir compte de la nécessité de l'enquêteur, telles que la sensibilité du complexe Ca2 + EGTA ou 13.
Les progrès récents dans les deux instruments et la méthodologie ont permis des avancées significatives dans l'application de la microscopie électronique (EM) pour la détermination de la structure, qui ont conduit à haute, près des images de résolution atomiques des complexes macromoléculaires 14. La résolution obtenue d'un complexe par EM, cependant, reste subordonnée à la qualité du complexe à l'étude. Cette étude a utilisé l'approche TAP tag pour purifier de S. cerevisiae U1 snRNP, un 18 sous-unité (~ 0,8 MDa) complexe ribonucléoprotéine faible nombre de copies qui fait partie de l'épissage 15,16. Un certain nombre de mesures ont été prises pour purifier ce complexe de telle sorte qu'il est homogène et d'une concentration adéquate. Les problèmes potentiels rencontrés à diverses étapes de la purification sont décrits et les stratégies prises pour surmonter challenges mis en évidence. Par soigneusement évaluer et d'optimiser les étapes de la purification, l'U1 snRNP purifié est d'une qualité et à une quantité appropriée pour coloration négative et électronique cryo microscopie études (cryo-EM). Un optimisé TAP méthode protocole pour la purification des complexes natifs pour des études structurales est décrit ici.
Protocol
Representative Results
Discussion
La méthode TAP utilise deux balises qui équilibrent un besoin pour la liaison rigoureuse et sélective à une résine d'affinité avec un désir de maintenir près des conditions de solution physiologique. Cet équilibre permet de préserver l'interaction stable (s) de la protéine marquée avec l'interaction facteur (s) pour la post-purification de caractérisation. En outre, la TAP individuelle étiqueté ORFs sont disponibles à partir d'une source commerciale, de sorte que l'on peut obtenir tou…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors are grateful for the support and advice of Nikolaus Grigorieff. We thank Anna Loveland, Axel Brilot, Chen Xu, and Mike Rigney for helpful discussions and EM guidance. This work was funded by the National Science Foundation, Award No. 1157892. The Brandeis EM facility is supported by National Institutes of Health grant P01 GM62580.
Materials
| S. cerevisiae TAP tagged strain | Open Biosystems | YSC1177 | This is the primary yeast strain used to develop the TAP protocol. Its background is S288C: ATCC 201388: MATa, his3Δ1, leu2Δ0, met15Δ0, ura3Δ0, SNU71::TAP::HIS3MX6 |
| Coffee grinder | Mr. Coffee | IDS77 | Used for cell lysis |
| Hemocytometer, Bright Line | Hausser Scientific | 3120 | Used to assess cell lysis |
| JA 9.100 centrifuge rotor | Beckman Coulter, Inc. | Used to harvest the yeast cells | |
| JA 20 fixed-angle centrifuge rotor | Beckman Coulter, Inc. | Used to clear the cell extract of non-soluble cellular material | |
| Ti 60 fixed-angle centrifuge rotor | Beckman Coulter, Inc. | Used to further clear the soluble cell extract | |
| Thermomixer | Eppendorf | R5355 | Temperature controlled shaker |
| Novex gel system | Thermo Fisher Scientific | ||
| IgG resin | GE Healthcare | 17-0969-01 | Sepharose 6 fast flow |
| Calmodulin resin | Agilent Technologies, Inc. | 214303 | Affinity resin |
| Protease inhibitor cocktail, mini tablets | Sigma Aldrich | 589297 | Mini cOmplete ultra EDTA-free tablets |
| Protease inhibitor cocktail, large tablets | Sigma Aldrich | 5892953 | cOmplete ultra EDTA-free tablets |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | Dissolved in isopropanol | ||
| 2 mL Bio-spin column | Bio-Rad Laboratories, Inc. | 7326008 | Used to pack and wash the Calmodulin resin |
| 10 mL poly-prep column | Bio-Rad Laboratories, Inc. | 7311550 | Used to pack and wash the IgG resin |
| Precast native PAGE Bis-Tris gels | Life Technologies | BN1002 | Novex NativePAGE Bis-Tris 4-16% precast polyacrylamide gels |
| NativeMark protein standard | Thermo Fisher Scientific | LC0725 | Unstained protein standard used for native PAGE. Load 7.5 μL for a silver stained gel and 5 μL for a SYPRO Ruby stained gel |
| Precast SDS PAGE Bis-Tris gels | Life Technologies | NP0321 | Novex Nu-PAGE Bis-Tris 4-12% precast polyacrylamide gels |
| PageRuler protein standard | Thermo Fisher Scientific | 26614 | Unstained protein standard used for Western blotting |
| SDS running buffer | Life Technologies | NP0001 | 1x NuPAGE MOPS SDS Buffer |
| TAP antibody | Thermo Fisher Scientific | CAB1001 | Primary antibody against CBP tag |
| Secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | 31341 | Goat anti-rabbit alkaline phosphatase conjugated |
| BCIP/NBT | Thermo Fisher Scientific | 34042 | 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate/nitro blue tetrazolium |
| Dialaysis units | Thermo Fisher Scientific | 88401 | Slide-A-Lyzer mini dialysis units |
| Centrifugal filter units, 100kDa MWCO | EMD Millipore | UFC5100008 | Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-100 membrane |
| Detergent absorbing beads | Bio-Rad Laboratories, Inc. | 1523920 | Bio-bead SM-2 absorbants |
| SYBR Green II | Thermo Fisher Scientific | S-7564 | Flourescent dye for nucleic acid staining, when detecting with SYPRO Ruby present, use excitation wavelength of 488 nm and emission wavelength of 532 nm |
| SYPRO Ruby | Molecular Probes | S-12000 | Flourescent dye for protein staining, when detecting with SYBR Green II present, use excitation wavelength of 457 nm and emission wavelength of 670 nm |
| Copper grids | Electron Microscopy Sciences | G400-CP |
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