Purificazione di Native Complessi di studio strutturale utilizzando un metodo Tag Tandem Affinity
Summary
The Tandem Affinity Purification (TAP) method has been used extensively to isolate native complexes from cellular extract, primarily eukaryotic, for proteomics. Here, we present a TAP method protocol optimized for purification of native complexes for structural studies.
Abstract
approcci purificazione per affinità sono riusciti ad isolare complessi native per la caratterizzazione proteomica. eterogeneità strutturale e un grado di eterogeneità composizionale di un complesso di solito non impediscono progressi nel condurre tali studi. Al contrario, un complesso destinato caratterizzazione strutturale deve essere purificato in uno stato che è sia per composizione e strutturalmente omogeneo, nonché ad una maggiore concentrazione di quanto richiesto per proteomica. Recentemente, ci sono stati progressi significativi nell'applicazione di microscopia elettronica per la determinazione della struttura di grandi complessi macromolecolari. Questo ha accresciuto interesse per approcci per purificare complessi nativi di qualità sufficiente e quantità per la determinazione strutturale di microscopia elettronica. Il metodo Tandem Affinity Purification (TAP) è stato ottimizzato per estrarre e purificare un 18-subunità, ~ 0.8 MDa assemblaggio ribonucleoproteico dal lievito in erba (Saccharomyces cerevisiae) </em> adatto a macchia negativa e crioconservati microscopia elettronica. In questo è dettagliato le modifiche apportate al metodo TAP, il razionale per fare questi cambiamenti, e gli approcci adottati per test per un complesso compositivo e strutturalmente omogeneo.
Introduction
Molti importanti processi cellulari sono svolte da grande proteina e proteina-RNA complessi 1. Un collo di bottiglia di eseguire studi biofisici e strutturali tali complessi loro è ottenere una adeguata qualità (cioè, l'omogeneità) e ad una idonea concentrazione. Isolare un complesso da una fonte nativa ha molti vantaggi, tra cui trattenere rilevanti modificazioni post-trascrizionali e / o traslazione di subunità e assicurare il corretto assemblaggio complesso. Tuttavia, grandi complessi cellulari sono spesso presenti in una cellula ad un basso numero di copia e la purificazione devono essere altamente efficiente e verificarsi in condizioni fisiologiche vicino per assicurare l'integrità complesso è mantenuta. Purificare un complesso da una fonte eucariotica è particolarmente impegnativo e può essere finanziariamente proibitivo. Così, le strategie o metodi che siano efficienti e producono un complesso omogeneo sono altamente desiderata.
Una strategia che è statasuccesso nel purificare complessi nativi di cellule eucariotiche per la loro caratterizzazione iniziale è il metodo Tandem Affinity Purification (TAP) 2,3. Il metodo TAP è stato inizialmente concepito per purificare una proteina nativa dal lievito in erba (S. cerevisiae) in complesso con l'interazione fattore (s) 2. Il metodo utilizzato TAP due tag, ogni tag fusa in tandem per la stessa sequenza del gene della proteina-codifica. I tag sono stati selezionati in modo da bilanciare la necessità di rigorosa e selettiva legame una resina di affinità con un desiderio di mantenere condizioni quasi soluzione fisiologica. Questo equilibrio serve a preservare l'interazione stabile (s) della proteina tag con l'interazione dei fattori (s) per la caratterizzazione post-purificazione. Il tag TAP genomicamente incorporata è stata posta alla fine (C-terminale) di un gene codificante e consisteva di una sequenza codificante per un Calmodulin Binding Peptide (CBP) seguita da Protein A – un'aggiunta di poco più di 20 kDa la targhetta proteina. CBP è breve, 26 amminoacidi, e riconosciuti dal ~ 17 kDa proteina calmodulina (CaM) in presenza di calcio con una K D dell'ordine di 10 -9 M 4. Il tag Proteina A è maggiore, costituito da due ripetizioni di 58 residui con una breve linker tra le ripetizioni. Ogni ripetizione acid 58 amino è riconosciuto da immunoglobulina G (IgG) con K D ~ 10 -8 M 5. Tra questi due tag è stato incorporato un sito di riconoscimento per il TEV proteasi, un endopeptidasi dal virus Tobacco Etch 6,7. Come illustrato in figura 1, nella prima fase affinità del metodo TAP etichettato proteina è fissata su una resina IgG tramite la proteina A. La proteina marcata è eluito su colonna di scissione dopo l'aggiunta del TEV proteasi, sito-specifica tra cleaving i due tag. Questo è un passo necessario come l'interazione di IgG e proteina A è molto forte e solo può essere adeguatamente perturbata in condizioni denaturanti soluzione. In mancanza di un Protein Un tag, la proteina si lega alla resina CaM in presenza di calcio e eluita da questa resina con aggiunta di EGTA ione metallico chelante (acido tetraacetico etilenglicole) (Figura 1).
Subito dopo l'introduzione del metodo TAP, è stato utilizzato in uno studio su larga scala per generare un 'map' di interazioni complesse S. cerevisiae 8. È importante sottolineare che, come conseguenza di questo sforzo un intero telaio di lievito-TAP Tagged Open Reading (ORF) biblioteca, così come TAP individuo etichettato ORF 9 sono disponibili da una fonte commerciale. Così, si può ottenere un ceppo di lievito con una proteina codificata per qualsiasi complesso lievito. Il metodo TAP anche stimolato modifiche o varianti del tag TAP, tra cui: il suo utilizzo per la purificazione di complessi provenienti da altri eucariotica così come le cellule batteriche 10,11; la progettazione di un "tag raggruppati", in cui la proteina A e CBP sono posti su differenti proteine 12; e la tags cambiato, in modo da accogliere la necessità del ricercatore, come la sensibilità del complesso Ca 2+ o EGTA 13.
I recenti progressi sia in strumentazione e metodologie hanno portato a progressi significativi nell'applicazione di microscopia elettronica (EM) per la determinazione della struttura, che hanno portato in alto, nei pressi di immagini atomiche risoluzione di complessi macromolecolari 14. La risoluzione ottenibile di un complesso di EM, tuttavia, resta subordinata alla qualità del complesso in esame. Questo studio ha utilizzato l'approccio tag TAP per purificare da S. cerevisiae U1 snRNP, un 18-subunità (~ 0,8 MDA) a basso numero di copie complesso ribonucleoproteico che fa parte del spliceosome 15,16. Un certo numero di passi sono stati compiuti per purificare questo complesso tale che è omogenea e di una concentrazione adeguata. Potenziali problemi riscontrati nelle varie fasi della purificazione sono descritti e strategie adottate per superare challEnges evidenziati. Valutando con attenzione e ottimizzando passi nella purificazione, l'U1 snRNP purificato è di una qualità e ad un quantitativo adatto per macchia negativa e (crio-EM) studi di elettroni crio microscopia. Un metodo ottimizzato protocollo TAP per la purificazione di complessi native per studi strutturali è descritta nel presente documento.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il metodo TAP utilizza due tag che bilanciano la necessità di rigorosa e selettiva legame con una resina di affinità con un desiderio di mantenere vicino a condizioni di soluzioni fisiologiche. Questo equilibrio serve a preservare l'interazione stabile (s) della proteina tag con l'interazione dei fattori (s) per la caratterizzazione post-purificazione. Inoltre, TAP individuo etichettato ORF sono disponibili da una fonte commerciale, in modo che si può ottenere qualsiasi ceppo di lievito con una proteina codif…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors are grateful for the support and advice of Nikolaus Grigorieff. We thank Anna Loveland, Axel Brilot, Chen Xu, and Mike Rigney for helpful discussions and EM guidance. This work was funded by the National Science Foundation, Award No. 1157892. The Brandeis EM facility is supported by National Institutes of Health grant P01 GM62580.
Materials
| S. cerevisiae TAP tagged strain | Open Biosystems | YSC1177 | This is the primary yeast strain used to develop the TAP protocol. Its background is S288C: ATCC 201388: MATa, his3Δ1, leu2Δ0, met15Δ0, ura3Δ0, SNU71::TAP::HIS3MX6 |
| Coffee grinder | Mr. Coffee | IDS77 | Used for cell lysis |
| Hemocytometer, Bright Line | Hausser Scientific | 3120 | Used to assess cell lysis |
| JA 9.100 centrifuge rotor | Beckman Coulter, Inc. | Used to harvest the yeast cells | |
| JA 20 fixed-angle centrifuge rotor | Beckman Coulter, Inc. | Used to clear the cell extract of non-soluble cellular material | |
| Ti 60 fixed-angle centrifuge rotor | Beckman Coulter, Inc. | Used to further clear the soluble cell extract | |
| Thermomixer | Eppendorf | R5355 | Temperature controlled shaker |
| Novex gel system | Thermo Fisher Scientific | ||
| IgG resin | GE Healthcare | 17-0969-01 | Sepharose 6 fast flow |
| Calmodulin resin | Agilent Technologies, Inc. | 214303 | Affinity resin |
| Protease inhibitor cocktail, mini tablets | Sigma Aldrich | 589297 | Mini cOmplete ultra EDTA-free tablets |
| Protease inhibitor cocktail, large tablets | Sigma Aldrich | 5892953 | cOmplete ultra EDTA-free tablets |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | Dissolved in isopropanol | ||
| 2 mL Bio-spin column | Bio-Rad Laboratories, Inc. | 7326008 | Used to pack and wash the Calmodulin resin |
| 10 mL poly-prep column | Bio-Rad Laboratories, Inc. | 7311550 | Used to pack and wash the IgG resin |
| Precast native PAGE Bis-Tris gels | Life Technologies | BN1002 | Novex NativePAGE Bis-Tris 4-16% precast polyacrylamide gels |
| NativeMark protein standard | Thermo Fisher Scientific | LC0725 | Unstained protein standard used for native PAGE. Load 7.5 μL for a silver stained gel and 5 μL for a SYPRO Ruby stained gel |
| Precast SDS PAGE Bis-Tris gels | Life Technologies | NP0321 | Novex Nu-PAGE Bis-Tris 4-12% precast polyacrylamide gels |
| PageRuler protein standard | Thermo Fisher Scientific | 26614 | Unstained protein standard used for Western blotting |
| SDS running buffer | Life Technologies | NP0001 | 1x NuPAGE MOPS SDS Buffer |
| TAP antibody | Thermo Fisher Scientific | CAB1001 | Primary antibody against CBP tag |
| Secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | 31341 | Goat anti-rabbit alkaline phosphatase conjugated |
| BCIP/NBT | Thermo Fisher Scientific | 34042 | 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate/nitro blue tetrazolium |
| Dialaysis units | Thermo Fisher Scientific | 88401 | Slide-A-Lyzer mini dialysis units |
| Centrifugal filter units, 100kDa MWCO | EMD Millipore | UFC5100008 | Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-100 membrane |
| Detergent absorbing beads | Bio-Rad Laboratories, Inc. | 1523920 | Bio-bead SM-2 absorbants |
| SYBR Green II | Thermo Fisher Scientific | S-7564 | Flourescent dye for nucleic acid staining, when detecting with SYPRO Ruby present, use excitation wavelength of 488 nm and emission wavelength of 532 nm |
| SYPRO Ruby | Molecular Probes | S-12000 | Flourescent dye for protein staining, when detecting with SYBR Green II present, use excitation wavelength of 457 nm and emission wavelength of 670 nm |
| Copper grids | Electron Microscopy Sciences | G400-CP |
References
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