Rening av Native Anläggningar för struktur studie med en Tandem Affinity Tagg Metod
Summary
The Tandem Affinity Purification (TAP) method has been used extensively to isolate native complexes from cellular extract, primarily eukaryotic, for proteomics. Here, we present a TAP method protocol optimized for purification of native complexes for structural studies.
Abstract
Affinitetsreningsmetoder har varit framgångsrika i att isolera infödda komplex för proteomik karakterisering. Strukturell heterogenitet och en grad av kompositions heterogenitet en komplex brukar inte hindra framsteg i att genomföra sådana studier. Däremot bör en komplex avsedd för strukturell karakterisering renas i ett tillstånd som är både sin sammansättning och strukturellt homogen samt vid en högre koncentration än vad som krävs för proteomik. På senare tid har det skett betydande framsteg i tillämpningen av elektronmikroskopi för strukturbestämning av stora makromolekylära komplex. Detta har ökat intresset för metoder att rena infödda komplex av tillräcklig kvalitet och kvantitet för strukturbestämning av elektronmikroskopi. Metoden Tandem Affinity Purification (TAP) har optimerats för att extrahera och rena ett 18-subenhet, ~ 0,8 MDa ribonukleoprotein enheten från knoppande jäst (Saccharomyces cerevisiae) </em> lämpar sig för negativa fläcken och elektron Cryo mikroskopi. Häri ligger närmare de ändringar som gjorts till TAP-metoden, den logiska grunden för att göra dessa förändringar, och de metoder som används för att analysera för en kompositions och strukturellt homogent komplex.
Introduction
Många stora cellulära processer utförs av stora protein- och protein-RNA-komplex 1. En betydande flaskhals att bedriva biofysikaliska och strukturella studier av sådana komplex är att få dem en lämplig kvalitet (dvs homogenitet) och vid en lämplig koncentration. Isolering av en komplex från en nativ källa har många fördelar, bland annat att behålla relevanta post-transkriptionella och / eller translationella modifieringar av subenheter och försäkring korrekt komplex montering. Men stora cellulära komplex är ofta närvarande i en cell på ett lågt kopietal och reningen måste vara effektiv och ske under nära fysiologiska förhållanden för att säkerställa komplexa integritet upprätthålls. Rening av ett komplex av en eukaryot källa är särskilt utmanande och kan vara ekonomiskt oöverkomliga. Således är strategier och metoder som är effektiva och ger en homogen komplex mycket önskvärt.
En strategi som har varitframgångsrika i att rena infödda komplex från eukaryota celler för deras första karakterisering är Tandem Affinity Purification (TAP) metoden 2,3. TAP-metoden var ursprungligen utformades för att rena ett nativt protein från knoppande jäst (S. cerevisiae) i komplex med samverkande faktor (er) 2. TAP-metod som användes två taggar, varvid varje tagg fuserad i tandem till samma proteinkodande gensekvensen. Taggarna valdes så att balansera ett behov av stram och selektiv bindning till en affinitets harts med en önskan att bibehålla nära fysiologiska betingelser lösning. Denna balans tjänar till att bevara stabil interaktion (er) av det märkta proteinet med samverkande faktor (er) för post-rening karakterisering. Den genomiskt inkorporerade TAP-taggen placerades vid änden (C-terminala) av ett protein-kodande genen och bestod av en sekvens som kodar för en Calmodulin-bindande peptid (CBP) följt av protein A – en tillsats av drygt 20 kDa till den taggade protein. CBP är kort, 26 aminosyror, och erkänns av ~ 17 kDa protein Calmodulin (CAM) i närvaro av kalcium med en K D i storleksordningen 10 -9 M 4. Protein En tagg är större, som består av två upprepningar av 58 rester med en kort linker mellan upprepningarna. Varje 58 aminosyror upprepning är erkänd av immunglobulin G (IgG) med ett Kd ~ 10 -8 M 5. Mellan dessa två taggar införlivades ett igenkänningsställe för TEV-proteas, ett endopeptidas från tobaks Etch Virus 6,7. Såsom illustreras i figur 1, i det första affinitetssteget enligt förfarandet TAP taggade proteinet är bundet till en IgG-matrisen via protein A. Den märkta proteinet elueras genom på kolonn klyvning vid tillsats av TEV-proteas, platsspecifikt klyvning mellan de två taggar. Detta är ett nödvändigt steg som interaktionen av IgG och protein A är mycket stark och kan endast vara tillräckligt störs under denaturerande betingelser lösning. I brist på en Protein En tagg proteinet bundet till CAM harts i närvaro av kalcium och elueras från detta harts med tillsats av metalljoner kela EGTA (etylenglykol-tetraättiksyra) (Figur 1).
Strax efter det att införandet av den TAP-metoden, användes den i en storskalig studie för att generera en "karta" av komplexa interaktioner i S. cerevisiae 8. Viktigare, som en följd av detta arbete en hel jäst-TAP taggade öppen läsram (ORF) bibliotek samt individuell TAP taggade ORF 9 är tillgängliga från en kommersiell källa. Sålunda kan man erhålla varje jäststam med ett märkt protein för någon jäst komplex. TAP metoden sporrade också modifieringar eller varianter av TAP-taggen, inklusive: dess användning för rening av komplex från andra eukaryota liksom bakterieceller 10,11; utformningen av en "split tag", vari protein A och CBP är placerade på olika proteiner 12; och TAgs ändrats, så att tillgodose behovet av utredaren, såsom känslighet av komplexet till Ca2 + eller EGTA 13.
Senaste framstegen inom både instrumentering och metoder har lett till betydande framsteg i tillämpningen av elektronmikroskopi (EM) för strukturbestämning, som har lett till hög, nära atom upplösning av makromolekylära komplex 14. Upplösningen kan erhållas av ett komplex av EM, är dock fortfarande knuten kvaliteten av komplexet under utredning. Denna studie har utnyttjat TAP taggen metod för att rena från S. cerevisiae U1 snRNP, en 18-subenhet (~ 0,8 MDA) lågt kopietal ribonukleoprotein komplex som är en del av spliceosom 15,16. Ett antal åtgärder har vidtagits för att rena detta komplex så att den är homogen och av en lämplig koncentration. Potentiella problem vid olika stadier av reningen beskrivs och strategier som vidtagits för att övervinna ChallEnges markerat. Genom att noggrant utvärdera och optimera steg i reningen, renas U1 snRNP är av en kvalitet och på en mängd lämplig för negativa fläcken och elektron kryo mikroskop (Cryo-EM) studier. En optimerad TAP metod protokoll för rening av infödda komplex för strukturella studier beskrivs häri.
Protocol
Representative Results
Discussion
TAP Metoden utnyttjar två taggar som balanserar ett behov av stram och selektiv bindning till en affinitets harts med en önskan att bibehålla nära fysiologiska betingelser lösning. Denna balans tjänar till att bevara stabil interaktion (er) av det märkta proteinet med samverkande faktor (er) för post-rening karakterisering. Dessutom taggade individuell TAP ORF är tillgängliga från en kommersiell källa, så att man kan erhålla något av jäststam med ett märkt protein för någon jäst komplex. Bevara integ…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors are grateful for the support and advice of Nikolaus Grigorieff. We thank Anna Loveland, Axel Brilot, Chen Xu, and Mike Rigney for helpful discussions and EM guidance. This work was funded by the National Science Foundation, Award No. 1157892. The Brandeis EM facility is supported by National Institutes of Health grant P01 GM62580.
Materials
| S. cerevisiae TAP tagged strain | Open Biosystems | YSC1177 | This is the primary yeast strain used to develop the TAP protocol. Its background is S288C: ATCC 201388: MATa, his3Δ1, leu2Δ0, met15Δ0, ura3Δ0, SNU71::TAP::HIS3MX6 |
| Coffee grinder | Mr. Coffee | IDS77 | Used for cell lysis |
| Hemocytometer, Bright Line | Hausser Scientific | 3120 | Used to assess cell lysis |
| JA 9.100 centrifuge rotor | Beckman Coulter, Inc. | Used to harvest the yeast cells | |
| JA 20 fixed-angle centrifuge rotor | Beckman Coulter, Inc. | Used to clear the cell extract of non-soluble cellular material | |
| Ti 60 fixed-angle centrifuge rotor | Beckman Coulter, Inc. | Used to further clear the soluble cell extract | |
| Thermomixer | Eppendorf | R5355 | Temperature controlled shaker |
| Novex gel system | Thermo Fisher Scientific | ||
| IgG resin | GE Healthcare | 17-0969-01 | Sepharose 6 fast flow |
| Calmodulin resin | Agilent Technologies, Inc. | 214303 | Affinity resin |
| Protease inhibitor cocktail, mini tablets | Sigma Aldrich | 589297 | Mini cOmplete ultra EDTA-free tablets |
| Protease inhibitor cocktail, large tablets | Sigma Aldrich | 5892953 | cOmplete ultra EDTA-free tablets |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | Dissolved in isopropanol | ||
| 2 mL Bio-spin column | Bio-Rad Laboratories, Inc. | 7326008 | Used to pack and wash the Calmodulin resin |
| 10 mL poly-prep column | Bio-Rad Laboratories, Inc. | 7311550 | Used to pack and wash the IgG resin |
| Precast native PAGE Bis-Tris gels | Life Technologies | BN1002 | Novex NativePAGE Bis-Tris 4-16% precast polyacrylamide gels |
| NativeMark protein standard | Thermo Fisher Scientific | LC0725 | Unstained protein standard used for native PAGE. Load 7.5 μL for a silver stained gel and 5 μL for a SYPRO Ruby stained gel |
| Precast SDS PAGE Bis-Tris gels | Life Technologies | NP0321 | Novex Nu-PAGE Bis-Tris 4-12% precast polyacrylamide gels |
| PageRuler protein standard | Thermo Fisher Scientific | 26614 | Unstained protein standard used for Western blotting |
| SDS running buffer | Life Technologies | NP0001 | 1x NuPAGE MOPS SDS Buffer |
| TAP antibody | Thermo Fisher Scientific | CAB1001 | Primary antibody against CBP tag |
| Secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | 31341 | Goat anti-rabbit alkaline phosphatase conjugated |
| BCIP/NBT | Thermo Fisher Scientific | 34042 | 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate/nitro blue tetrazolium |
| Dialaysis units | Thermo Fisher Scientific | 88401 | Slide-A-Lyzer mini dialysis units |
| Centrifugal filter units, 100kDa MWCO | EMD Millipore | UFC5100008 | Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-100 membrane |
| Detergent absorbing beads | Bio-Rad Laboratories, Inc. | 1523920 | Bio-bead SM-2 absorbants |
| SYBR Green II | Thermo Fisher Scientific | S-7564 | Flourescent dye for nucleic acid staining, when detecting with SYPRO Ruby present, use excitation wavelength of 488 nm and emission wavelength of 532 nm |
| SYPRO Ruby | Molecular Probes | S-12000 | Flourescent dye for protein staining, when detecting with SYBR Green II present, use excitation wavelength of 457 nm and emission wavelength of 670 nm |
| Copper grids | Electron Microscopy Sciences | G400-CP |
References
- Gavin, A. C., et al. Functional organization of the yeast proteome by systematic analysis of protein complexes. Nature. 415 (6868), 141-147 (2002).
- Rigaut, G., Shevchenko, A., Rutz, B., Wilm, M., Mann, M., Seraphin, B. A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration. Nature Biotechnology. 17 (10), 1030-1032 (1999).
- Puig, O., et al. The tandem affinity purification (TAP) method: A general procedure of protein complex purification. Methods. 24 (3), 218-229 (2001).
- Vaillancourt, P., Zheng, C. F., Hoang, D. Q., Breister, L. Affinity purification of recombinant proteins fused to calmodulin or to calmodulin-binding peptides. Methods Enzymol. 326, 340-362 (2000).
- Braisted, A. C., Wells, J. A. Minimizing a binding domain from protein A. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (12), 5688-5692 (1996).
- Kapust, R. B., et al. Tobacco etch virus protease: mechanism of autolysis and rational design of stable mutants with wild-type catalytic proficiency. Protein Eng. 14 (12), 993-1000 (2001).
- Nallamsetty, S., et al. Efficient site-specific processing of fusion proteins by tobacco vein mottling virus protease in vivo and in vitro. Protein Expr Purif. 38 (1), 108-115 (2004).
- Ghaemmaghami, S., et al. Global analysis of protein expression in yeast. Nature. 425 (6959), 737-741 (2003).
- Howson, R., et al. Construction, verification and experimental use of two epitope-tagged collections of budding yeast strains. Comp Funct Genomics. 6 (1-2), 2-16 (2005).
- Cox, D. M., Du, M., Guo, X., Siu, K. W., McDermott, J. C. Tandem affinity purification of protein complexes from mammalian cells. Biotechniques. 33 (2), 267-268 (2002).
- Gully, D., Moinier, D., Loiseau, L., Bouveret, E. New partners of acyl carrier protein detected in Escherichia coli by tandem affinity purification. FEBS Lett. 548 (1-3), 90-96 (2003).
- Tharun, S. Purification and analysis of the decapping activator Lsm1p-7p-Pat1p complex from yeast. Methods Enzymol. 448, 41-55 (2008).
- Xu, X., Song, Y., Li, Y., Chang, J., Zhang, H., An, L. The tandem affinity purification method: an efficient system for protein complex purification and protein interaction identification. Protein Expr Purif. 72 (2), 149-156 (2010).
- Cheng, Y., Grigorieff, N., Penczek, P. A., Walz, T. A Primer to Single-Particle Cryo-Electron Microscopy. Cell. 161 (3), 438-449 (2015).
- Gottschalk, A., et al. A comprehensive biochemical and genetic analysis of the yeast U1 snRNP reveals five novel proteins. RNA. 4 (4), 374-393 (1998).
- Neubauer, G., Gottschalk, A., Fabrizio, P., Seraphin, B., Luhrmann, R., Mann, M. Identification of the proteins of the yeast U1 small nuclear ribonucleoprotein complex by mass spectrometry. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (2), 385-390 (1997).
- Lucast, L. J., Batey, R. T., Doudna, J. A. Large-scale purification of a stable form of recombinant tobacco etch virus protease. Biotechniques. 30 (3), 544-546 (2001).
