L'isolement des Cognate complexes ARN-protéine à partir des cellules en utilisant une élution Oligonucleotide-directed
Summary
This manuscript describes an approach to isolate select cognate RNPs formed in eukaryotic cells via a specific oligonucleotide-directed enrichment. We demonstrate the applicability of this approach by isolating a cognate RNP bound to the retroviral 5′ untranslated region that is composed of DHX9/RNA helicase A.
Abstract
Ribonucleoprotein particles direct the biogenesis and post-transcriptional regulation of all mRNAs through distinct combinations of RNA binding proteins. They are composed of position-dependent, cis-acting RNA elements and unique combinations of RNA binding proteins. Defining the composition of a specific RNP is essential to achieving a fundamental understanding of gene regulation. The isolation of a select RNP is akin to finding a needle in a haystack. Here, we demonstrate an approach to isolate RNPs associated at the 5′ untranslated region of a select mRNA in asynchronous, transfected cells. This cognate RNP has been demonstrated to be necessary for the translation of select viruses and cellular stress-response genes.
The demonstrated RNA-protein co-precipitation protocol is suitable for the downstream analysis of protein components through proteomic analyses, immunoblots, or suitable biochemical identification assays. This experimental protocol demonstrates that DHX9/RNA helicase A is enriched at the 5′ terminus of cognate retroviral RNA and provides preliminary information for the identification of its association with cell stress-associated huR and junD cognate mRNAs.
Introduction
l'expression génique post-transcriptionnelle est régulée avec précision, en commençant par transcription de l'ADN dans le noyau. Contrôlée par des protéines de liaison d' ARN (RBP), l' ARNm de la biogenèse et le métabolisme se produisent dans les particules de ribonucléoprotéine hautement dynamiques (RNP), qui se dissocient et associé à un ARNm de précurseur de substrat au cours de la progression de l' ARN métabolisme 1-3. Les changements dynamiques dans les composants de RNP affectent le sort post-transcriptionnelle d'un ARNm et de fournir l'assurance de la qualité lors du traitement des transcrits primaires, leur trafic nucléaire et de la localisation, leur activité en tant que modèles d'ARNm pour la traduction, et le chiffre d'affaires éventuelle des ARNm matures.
De nombreuses protéines sont désignées comme RBP en raison de leurs domaines d'acides aminés conservés, y compris le motif de reconnaissance de l' ARN (RRM), l'ARN double brin domaine de liaison (RBD), et les portions de résidus basiques (par exemple, l' arginine, la lysine et la glycine) 4. RBP sont régulièrementisolé par des stratégies d'immunoprécipitation et sont criblées pour identifier leurs ARNs parentes. Certaines pratiques commerciales restrictives co-régulent pré-ARNm qui sont liées au plan fonctionnel, désignés comme régulons d'ARN 5-8. Ces pratiques commerciales restrictives, leurs ARNm parentes, et parfois non codant l'ARN, forment RNP catalytiques qui varient dans la composition; leur spécificité est due à différentes combinaisons de facteurs associés, ainsi que la séquence temporelle, l' emplacement et la durée de leurs interactions 9.
ARN immunoprécipitation (RIP) est une technique puissante pour isoler RNP à partir de cellules et d'identifier les transcriptions associées à l' aide de l' analyse de la séquence 10-13. Passer de la candidate à l' échelle du génome de dépistage est possible par le biais RIP combiné avec une analyse des microréseaux 14 ou séquençage à haut débit (RNA-seq) 15. De même, les protéines de coprécipitation peuvent être identifiées par spectrométrie de masse, si elles sont suffisamment abondantes et séparable de l'anticorps co-précipitation 16,17. Ici, nous examinons la méthode pour isoler les composants de RNP d'un ARN spécifique apparenté à partir de cellules humaines en culture, bien que l'approche peut être modifiée pour lysats solubles dans des cellules végétales, des champignons, des virus et des bactéries. Les analyses en aval du matériau comprennent l' identification des candidats et validation par immunotransfert, spectrométrie de masse, dosage enzymatique biochimique, la RT-PCR quantitative, puces à ADN et RNA-seq, comme le résume la figure 1.
Étant donné le rôle fondamental de la RNP dans le contrôle de l' expression des gènes au niveau post-transcriptionnel, des altérations de l'expression de RBP composants ou leur accessibilité aux Apparenté ARNs peuvent être préjudiciables pour la cellule et sont associés à plusieurs types de troubles, y compris la maladie neurologique 18. DHX9 / ARN hélicase A (RHA) est nécessaire pour la traduction des ARNm sélectionnés d'origines cellulaires et rétroviraux 6. Ces ARN parentes présentent des éléments agissant en cis structurellement apparentés au sein de leur5 'UTR, qui est désigné comme l'élément de contrôle post-transcriptionnel (PCE) 19. Activité RHA-PCE est nécessaire pour la traduction cap-dépendante efficace de nombreux retrovirus, y compris le VIH-1, et des gènes régulateurs de croissance, y compris junD 6,20,21. Encodée par un gène essentiel (de dhx9), ORS est essentielle à la prolifération cellulaire et la régulation vers le bas élimine la viabilité des cellules 22. L'analyse moléculaire de l'ORS-PCE RNP est une étape essentielle pour comprendre pourquoi l'activité RHA-PCE est nécessaire de contrôler la prolifération des cellules.
La caractérisation précise des composants de RNP RHA-PCE à l'état stationnaire ou sur la perturbation physiologique de la cellule nécessite l'enrichissement sélectif et la capture des RNP RHA-PCE en abondance suffisante pour l'analyse en aval. Ici, rétroviral PCEgag ARN a été marqué avec 6 copies du site de liaison d'ARN agissant en cis pour la protéine d'enveloppe MS2 (CP) dans le cadre de lecture ouvert. La protéine de capside MS2 a été exogenously co-exprimée avec PCEgag ARN par transfection du plasmide pour faciliter l'assemblage RNP dans les cellules en croissance. RNP contenant la protéine de capside MS2 avec PCEgag ARN MS2 cognât marqués ont été immunoprécipités à partir de l'extrait cellulaire et capturé sur des billes magnétiques (Figure 2a). Pour capturer de manière sélective les composants de RNP liés au PCE, RNP immobilisé a été mis en incubation avec un oligonucléotide complémentaire à des séquences distales de PCE, la formation d'un hybride ARN-ADN qui est le substrat pour l'activité RNase H. Etant donné que le PCE est positionné dans la région 5 'terminale de la région 5' non traduite, l'oligonucléotide est complémentaire des séquences d'ARN adjacentes au site d'initiation de traduction rétroviraux (codon de départ gag). RNase H clivage près du début de gag codon libéré complexe 5 'UTR du RNP immobilisé, qui a été recueilli comme éluant. Ensuite, l'échantillon a été évaluée par RT-PCR pour confirmer la prise de PCEgag et par SDS-PAGE et immunotransfert pour confirmer la capture de la protéine d'enveloppe cible MS2. Une validation de la protéine de liaison d'ARN PCE associée, DHX9 / ARN hélicase A, a ensuite été réalisée.
Protocol
Representative Results
Discussion
L'isolement de RNP et de la stratégie d'identification de l'ARN apparenté décrit ici est un moyen sélectif d'enquêter sur une interaction spécifique ARN-protéine et de la découverte des protéines candidats co-régulation d'un RNP spécifique dans les cellules.
L'avantage d'utiliser oligonucléotide clivage par RNase H d'isoler RNP est la capacité de capturer et analyser plus précisément l'élément d'ARN agissant en cis sur la RNP RNP hét?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs remercient le soutien par le NIH P50GM103297, P30CA100730 et Comprehensive Cancer P01CA16058.
Materials
| Dynabeads Protein A | Invitrogen | 10002D | |
| Dynabeads Protein G | Invitrogen | 10004D | |
| Anti- FLAG antibody | Sigma | F3165 | |
| Anti- FLAG antibody | Sigma | F7425 | |
| Anti-RHA antibody | Vaxron | PA-001 | |
| TRizol LS reagent | Life technology | 10296-028 | |
| RNase H | Ambion | AM2292 | |
| Chloroform | Fisher Scientific | BP1145-1 | |
| Isopropanol | Fisher Scientific | BP26184 | |
| RNaeasy clean-up column | Qiagen | 74204 | |
| Omniscript reverse transcriptase | Qiagen | 205113 | |
| RNase Out | Invitrogen | 10777-019 | |
| Protease inhibitor cocktail | Roche | 5056489001 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| NP-40 | Sigma | 98379 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | 17904 | |
| Random hexamer primers | Invitrogen | N8080127 | |
| Oligo-dT primers | Invitrogen | AM5730G | |
| PCR primers | IDT | Gene specific primers for PCR amplification | |
| Oligonucleotide for RNase H mediated cleavage | IDT | Anti-sense primer for target RNA | |
| Trypsin | Gibco Life technology | 25300-054 | |
| DMEM tissue culture medium | Gibco Life technology | 11965-092 | |
| Fetal bovine serum | Gibco Life technology | 10082-147 | |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152-5 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | S642-212 | |
| Magnesium chloride | Fisher Scientific | BP214 | |
| DTT | Fisher Scientific | R0862 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | BP220-212 | |
| Nitrocellulose membrane | Bio-Rad | 1620112 | |
| Magnetic stand | 1.7 ml micro-centrifuge tube holding | ||
| Laminar hood | For animal tissue culture | ||
| CO2 incubator | For animal tissue culture | ||
| Protein gel apparatus | Protein sample separation | ||
| Protein transfer apparatus | Protein sample transfer | ||
| Ready to use protein gels (4-15%) | Protein sample separation | ||
| Table top centrifuge | Pellet down the sample | ||
| Table top rotator | Mix the sample end to end | ||
| Vortex | Mix the samples |
References
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