Isolamento de complexos de ARN-proteína a partir de células Cognate usando eluição Oligonucleotide-directed
Summary
This manuscript describes an approach to isolate select cognate RNPs formed in eukaryotic cells via a specific oligonucleotide-directed enrichment. We demonstrate the applicability of this approach by isolating a cognate RNP bound to the retroviral 5′ untranslated region that is composed of DHX9/RNA helicase A.
Abstract
Ribonucleoprotein particles direct the biogenesis and post-transcriptional regulation of all mRNAs through distinct combinations of RNA binding proteins. They are composed of position-dependent, cis-acting RNA elements and unique combinations of RNA binding proteins. Defining the composition of a specific RNP is essential to achieving a fundamental understanding of gene regulation. The isolation of a select RNP is akin to finding a needle in a haystack. Here, we demonstrate an approach to isolate RNPs associated at the 5′ untranslated region of a select mRNA in asynchronous, transfected cells. This cognate RNP has been demonstrated to be necessary for the translation of select viruses and cellular stress-response genes.
The demonstrated RNA-protein co-precipitation protocol is suitable for the downstream analysis of protein components through proteomic analyses, immunoblots, or suitable biochemical identification assays. This experimental protocol demonstrates that DHX9/RNA helicase A is enriched at the 5′ terminus of cognate retroviral RNA and provides preliminary information for the identification of its association with cell stress-associated huR and junD cognate mRNAs.
Introduction
a expressão do gene pós-transcrição é regulada com precisão, começando com a transcrição do DNA no núcleo. Controlada pela ligação RNA proteínas (RBPs), mRNA biogênese e metabolismo ocorrem em partículas de ribonucleoproteínas altamente dinâmicos (RNPs), que se associam e dissociam com um mRNA precursor do substrato durante a progressão da RNA metabolismo 1-3. mudanças dinâmicas em componentes RNP afetar o destino pós-transcricional de um mRNA e fornecer garantia de qualidade durante o processamento de transcritos primários, seu tráfico nuclear e localização, a sua actividade como modelos de mRNA para a tradução, ea eventual volume de negócios de mRNAs maduros.
Numerosas proteínas são designadas como RBPs em virtude dos seus domínios de aminoácidos conservados, incluindo o motivo de reconhecimento de ARN (RRM), a cadeia dupla de ARN domínio de ligação (RBD), e trechos de resíduos básicos (por exemplo, arginina, lisina e glicina) 4. RBPs são rotineiramenteisolado por estratégias de imunoprecipitação e são selecionados para identificar os RNAs cognatos. Alguns RBPs co-regular pré-ARNm que estão relacionadas funcionalmente-, designados como regulons ARN 5-8. Estes RBPs, seus mRNAs cognatos, e às vezes RNA não-codificante, formar RNPs catalíticos que variam em composição; a sua singularidade se deve a várias combinações de factores associados, bem como a sequência temporal, localização, e a duração das suas interacções 9.
Imunoprecipitação ARN (RIP) é uma técnica poderosa para isolar RNP de células e para identificar transcritos associados utilizando análise da sequência 10-13. Mover-se de candidato a genoma-wide rastreio é viável através de RIP combinada com uma análise de microarray 14 ou sequenciamento de alto rendimento (RNA-Seq) 15. Do mesmo modo, as proteínas co-precipitação pode ser identificado por espectrometria de massa, se eles são suficientemente abundante e separável a partir do anticorpo de co-precipitante 16,17. Aqui, nos dirigimos a metodologia para o isolamento de componentes de RNP de um ARN cognato específico a partir de células humanas de cultura, embora a abordagem é alterável para lisados solúveis das células vegetais, fungos, vírus e bactérias. Análises a jusante do material incluem a identificação de candidatos e validação por imunotransferência, espectrometria de massa, ensaio enzimático bioquímica, RT-qPCR, microarray, e RNA-Seq, conforme resumido na Figura 1.
Dado o papel fundamental da RNP para controlar a expressão do gene ao nível pós-transcricional, alterações na expressão de RBPs componentes ou a sua acessibilidade às cognato RNAs pode ser prejudicial para a célula e está associada com vários tipos de afecções, incluindo a doença neurológica 18. DHX9 / RNA helicase A (RHA) é necessário para a tradução de mRNAs selecionados de origens celulares e retrovirais 6. Estes RNAs cognatos exibem elementos de actuação cis-estruturalmente relacionados dentro do seuUTR 5 ', que é designado como o elemento de controlo pós-transcricional (PCE) 19. Actividade RHA-PCE é necessário para a tradução eficiente dependente da tampa de diversos retrovirus, incluindo o HIV-1, e de genes reguladores do crescimento, incluindo Jund 6,20,21. Codificada por um gene essencial (dhx9), RHA é essencial para a proliferação celular e a sua infra-regulação elimina a viabilidade das células 22. A análise molecular de RHA-PCE RNP é um passo essencial para entender por que a atividade RHA-PCE é necessário controlar a proliferação celular.
A caracterização precisa dos componentes RNP RHA-PCE no estado estacionário, ou mediante perturbação fisiológica da célula requer o enriquecimento selectivo e captura das RNPs RHA-PCE em abundância suficiente para a análise a jusante. Aqui, o RNA retroviral PCEgag foi etiquetado com 6 cópias do local de ligação de ARN de actuação cis para a proteína de revestimento de MS2 (CP) dentro do enquadramento de leitura aberto. A proteína de revestimento de MS2 foi exogenously co-expressa com PCEgag ARN por transfecção do plasmídeo para facilitar a montagem RNP em células em crescimento. RNP contendo a proteína de revestimento de MS2 ARN com PCEgag cognato MS2-tagged foram imunoprecipitadas a partir do extracto celular e capturada em esférulas magnéticas (Figura 2A). Para capturar selectivamente os componentes ligados ao RNP PCE, a RNP imobilizado foi incubado com um oligonucleótido complementar a sequências distais ao PCE, formando um híbrido de ARN-ADN que é o substrato para a actividade de RNase H. Desde PCE é posicionado no 'terminal do 5' não traduzida a 5 região, o oligonucleótido é complementar às sequências de ARN adjacentes ao sítio de iniciação da tradução retroviral (gag codão de iniciação). Clivagem com ribonuclease H perto do início da mordaça codão libertado complexo UTR a 5 'a partir do RNP imobilizada, que foi recolhido como o eluente. Em seguida, a amostra foi avaliada por RT-PCR para confirmar a captura de PCEgag e por SDS-PAGE e imunotransf erência para confirmar a capture da proteína de revestimento alvo MS2. A validação da proteína de ligação a ARN-associado PCE, DHX9 / ARN helicase A, foi então realizada.
Protocol
Representative Results
Discussion
O isolamento RNP e estratégia de identificação RNA cognate aqui descrito é um meio seletivo de investigar a interacção RNA-proteína específica e de descobrir proteínas candidatas co-regulação de um RNP específica em células.
A vantagem de utilizar clivagem com ribonuclease H dirigida por oligonucleótidos para isolar RNP é a capacidade para capturar e analisar especificamente o elemento que actua em cis de ARN RNP sobre RNP heterogéneos ligados a jusante do elemento de ARN act…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores agradecem o apoio pelo NIH P50GM103297, P30CA100730 e Comprehensive Cancer P01CA16058.
Materials
| Dynabeads Protein A | Invitrogen | 10002D | |
| Dynabeads Protein G | Invitrogen | 10004D | |
| Anti- FLAG antibody | Sigma | F3165 | |
| Anti- FLAG antibody | Sigma | F7425 | |
| Anti-RHA antibody | Vaxron | PA-001 | |
| TRizol LS reagent | Life technology | 10296-028 | |
| RNase H | Ambion | AM2292 | |
| Chloroform | Fisher Scientific | BP1145-1 | |
| Isopropanol | Fisher Scientific | BP26184 | |
| RNaeasy clean-up column | Qiagen | 74204 | |
| Omniscript reverse transcriptase | Qiagen | 205113 | |
| RNase Out | Invitrogen | 10777-019 | |
| Protease inhibitor cocktail | Roche | 5056489001 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| NP-40 | Sigma | 98379 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | 17904 | |
| Random hexamer primers | Invitrogen | N8080127 | |
| Oligo-dT primers | Invitrogen | AM5730G | |
| PCR primers | IDT | Gene specific primers for PCR amplification | |
| Oligonucleotide for RNase H mediated cleavage | IDT | Anti-sense primer for target RNA | |
| Trypsin | Gibco Life technology | 25300-054 | |
| DMEM tissue culture medium | Gibco Life technology | 11965-092 | |
| Fetal bovine serum | Gibco Life technology | 10082-147 | |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152-5 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | S642-212 | |
| Magnesium chloride | Fisher Scientific | BP214 | |
| DTT | Fisher Scientific | R0862 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | BP220-212 | |
| Nitrocellulose membrane | Bio-Rad | 1620112 | |
| Magnetic stand | 1.7 ml micro-centrifuge tube holding | ||
| Laminar hood | For animal tissue culture | ||
| CO2 incubator | For animal tissue culture | ||
| Protein gel apparatus | Protein sample separation | ||
| Protein transfer apparatus | Protein sample transfer | ||
| Ready to use protein gels (4-15%) | Protein sample separation | ||
| Table top centrifuge | Pellet down the sample | ||
| Table top rotator | Mix the sample end to end | ||
| Vortex | Mix the samples |
References
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