Isolering av besläktade RNA-proteinkomplex från celler med användning av oligonukleotid-riktad Eluering
Summary
This manuscript describes an approach to isolate select cognate RNPs formed in eukaryotic cells via a specific oligonucleotide-directed enrichment. We demonstrate the applicability of this approach by isolating a cognate RNP bound to the retroviral 5′ untranslated region that is composed of DHX9/RNA helicase A.
Abstract
Ribonucleoprotein particles direct the biogenesis and post-transcriptional regulation of all mRNAs through distinct combinations of RNA binding proteins. They are composed of position-dependent, cis-acting RNA elements and unique combinations of RNA binding proteins. Defining the composition of a specific RNP is essential to achieving a fundamental understanding of gene regulation. The isolation of a select RNP is akin to finding a needle in a haystack. Here, we demonstrate an approach to isolate RNPs associated at the 5′ untranslated region of a select mRNA in asynchronous, transfected cells. This cognate RNP has been demonstrated to be necessary for the translation of select viruses and cellular stress-response genes.
The demonstrated RNA-protein co-precipitation protocol is suitable for the downstream analysis of protein components through proteomic analyses, immunoblots, or suitable biochemical identification assays. This experimental protocol demonstrates that DHX9/RNA helicase A is enriched at the 5′ terminus of cognate retroviral RNA and provides preliminary information for the identification of its association with cell stress-associated huR and junD cognate mRNAs.
Introduction
Post-transkriptionell genexpression är exakt reglerad, som börjar med DNA-transkription i kärnan. Styrs av RNA-bindande proteiner (RBP-anordningama), mRNA biogenes och metabolism förekommer i högdynamiska ribonukleoprotein partiklar (RNP), som associerar och separera med en substratprekursor mRNA under utvecklingen av RNA metabolism 1-3. Dynamiska förändringar i RNP komponenter påverkar den posttranskription öde en mRNA och kvalitetssäkra under bearbetningen av primära transkript, deras nukleära handel och lokalisering, deras aktivitet som mRNA mallar för översättning, och slutligen omsättning av mogna mRNA.
Talrika proteiner betecknas som RBP-anordningama i kraft av deras konserverade aminosyradomäner, inklusive den RNA-igenkänningsmotivet (RRM), det dubbelsträngade RNA-bindande domän (RBD) och sträckor av basiska rester (till exempel arginin, lysin och glycin) 4. RBP-anordningama är rutinmässigtisolerades genom immunfällning strategier och screenas för att identifiera sina besläktade RNA. Vissa RBP-anordningama samar reglera pre-mRNA som är funktionellt relaterade, betecknade RNA reguloner 5-8. Dessa RBP-anordningama, deras besläktade mRNA, och ibland icke-kodande RNA, bildar katalytiska RNP som varierar i sammansättning; deras unika beror på olika kombinationer av tillhörande faktorer, liksom till den temporala sekvensen, plats och varaktighet av deras interaktioner 9.
RNA immunoprecipitation (RIP) är en kraftfull teknik för att isolera RNP från celler och för att identifiera associerade transkript med hjälp av sekvensanalys 10-13. Flytta från kandidat till Genomvid screening är möjlig genom RIP kombinerat med en microarray analys 14 eller hög genomströmning sekvensering (RNAseq) 15. På samma sätt kan samutfällning proteiner identifieras genom masspektrometri, om de är tillräckligt rikliga och skiljas från samutfällning antikropp 16,17. Här, vi tar upp den metod för att isolera RNP-komponenterna i en specifik cognate RNA från odlade humana celler, även om tillvägagångssättet är ändringsbar för lösliga lysat av växtceller, svampar, virus och bakterier. Nedströms analyser av materialet innefattar identifieringskandidat och validering av immun, masspektrometri, biokemisk enzymatisk analys, RT-qPCR, microarray, och RNAseq, som sammanfattas i figur 1.
Med tanke på den grundläggande roll som RNP i att kontrollera genuttryck vid posttranskriptionsnivå, att förändringar i uttrycket av komponent RBP-anordningama eller deras tillgänglighet besläktade RNA kan vara skadligt för cellen och är förknippade med olika typer av sjukdomar, inklusive neurologisk sjukdom 18. DHX9 / RNA-helikas A (RHA) är nödvändig för översättning av utvalda mRNA av cellulära och retrovirala ursprung 6. Dessa besläktade RNA uppvisar strukturellt relaterade cis-verkande element inom deras5 'UTR, vilket betecknas som den post-transkriptionella styrelement (PCE) 19. RHA-PCE aktivitet är nödvändig för att effektivt cap-beroende översättning av många retrovirus, inklusive HIV-1, och av tillväxtreglerande gener, inklusive Jund 6,20,21. Kodas av en essentiell gen (dhx9), är avgörande för celltillväxt och dess nedreglering RHA eliminerar cellviabilitet 22. Den molekylär analys av RHA-PCE RNP är ett viktigt steg för att förstå varför RHA-PCE aktivitet är nödvändigt för att kontrollera celltillväxt.
Den exakta karakteriseringen av RHA-PCE RNP komponenter vid steady state eller vid fysiologisk störning av cellen kräver selektiv anrikning och fånga av RHA-PCE RNP tillräckligt överflöd för nedströms analys. Här var retroviralt PCEgag RNA taggade med 6 kopior av cis-verkande RNA-bindningsstället för MS2-höljeproteinet (CP) inom den öppna läsramen. MS2-höljeprotein var exogenously samuttryckt med PCEgag RNA genom plasmidtransfektion att underlätta RNP aggregatet i växande celler. RNP innehållande MS2-höljeproteinet med besläktat MS2-taggade PCEgag RNA immunutfälldes från cellextraktet och infångades på magnetiska pärlor (Figur 2A). Att selektivt fånga RNP komponenter bundna till PCE, var det immobiliserade RNP inkuberades med en oligonukleotid komplementär till sekvenser distala till PCE, som bildar en RNA-DNA-hybrid, som är substratet för RNas H-aktivitet. Eftersom PCE är placerad i 5 'terminalen av den 5'-otranslaterade regionen, oligonukleotiden var komplementär till de RNA-sekvenser som gränsar till den retrovirala translationsstartstället (gag-startkodonet). RNas H-spaltning i närheten av gag-startkodonet släppte 5 'UTR komplexet från immobiliserat RNP, som uppsamlades som elueringsmedel. Därefter ades provet utvärderades genom RT-PCR för att bekräfta infångning av PCEgag och genom SDS PAGE och immunoblotting för att bekräfta capture av målet MS2 päls protein. En kontroll av den PCE associerade RNA-bindande proteinet, DHX9 / RNA-helikas A, genomfördes därefter.
Protocol
Representative Results
Discussion
RNP isolering och besläktade RNA identifierings strategi som beskrivs här är en selektiv sätt att undersöka en specifik interaktion RNA-protein och att upptäcka kandidatproteiner samtidigt reglera en specifik RNP i celler.
Fördelen med att använda oligonukleotid-styrd RNas-H-spjälkning för att isolera RNP är förmågan att fånga och särskilt analysera den RNP cis-verkande RNA-elementet över heterogena RNP bundna nedströms till cis-agerande RNA-element av intresse. Eftersom öv…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna erkänner tacksamt stöd av NIH P50GM103297, P30CA100730 och Comprehensive Cancer P01CA16058.
Materials
| Dynabeads Protein A | Invitrogen | 10002D | |
| Dynabeads Protein G | Invitrogen | 10004D | |
| Anti- FLAG antibody | Sigma | F3165 | |
| Anti- FLAG antibody | Sigma | F7425 | |
| Anti-RHA antibody | Vaxron | PA-001 | |
| TRizol LS reagent | Life technology | 10296-028 | |
| RNase H | Ambion | AM2292 | |
| Chloroform | Fisher Scientific | BP1145-1 | |
| Isopropanol | Fisher Scientific | BP26184 | |
| RNaeasy clean-up column | Qiagen | 74204 | |
| Omniscript reverse transcriptase | Qiagen | 205113 | |
| RNase Out | Invitrogen | 10777-019 | |
| Protease inhibitor cocktail | Roche | 5056489001 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| NP-40 | Sigma | 98379 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | 17904 | |
| Random hexamer primers | Invitrogen | N8080127 | |
| Oligo-dT primers | Invitrogen | AM5730G | |
| PCR primers | IDT | Gene specific primers for PCR amplification | |
| Oligonucleotide for RNase H mediated cleavage | IDT | Anti-sense primer for target RNA | |
| Trypsin | Gibco Life technology | 25300-054 | |
| DMEM tissue culture medium | Gibco Life technology | 11965-092 | |
| Fetal bovine serum | Gibco Life technology | 10082-147 | |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152-5 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | S642-212 | |
| Magnesium chloride | Fisher Scientific | BP214 | |
| DTT | Fisher Scientific | R0862 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | BP220-212 | |
| Nitrocellulose membrane | Bio-Rad | 1620112 | |
| Magnetic stand | 1.7 ml micro-centrifuge tube holding | ||
| Laminar hood | For animal tissue culture | ||
| CO2 incubator | For animal tissue culture | ||
| Protein gel apparatus | Protein sample separation | ||
| Protein transfer apparatus | Protein sample transfer | ||
| Ready to use protein gels (4-15%) | Protein sample separation | ||
| Table top centrifuge | Pellet down the sample | ||
| Table top rotator | Mix the sample end to end | ||
| Vortex | Mix the samples |
References
- Bandziulis, R. J., Swanson, M. S., Dreyfuss, G. RNA-binding proteins as developmental regulators. Genes Dev. 3 (4), 431-437 (1989).
- Hogan, D. J., Riordan, D. P., Gerber, A. P., Herschlag, D., Brown, P. O. Diverse RNA-binding proteins interact with functionally related sets of RNAs, suggesting an extensive regulatory system. PLoS Biol. 6 (10), e255 (2008).
- Glisovic, T., Bachorik, J. L., Yong, J., Dreyfuss, G. RNA-binding proteins and post-transcriptional gene regulation. FEBS Lett. 582 (14), 1977-1986 (2008).
- Lunde, B. M., Moore, C., Varani, G. RNA-binding proteins: modular design for efficient function. Nat.Rev.Mol.Cell Biol. 8 (6), 479-490 (2007).
- Cochrane, A. W., McNally, M. T., Mouland, A. J. The retrovirus RNA trafficking granule: from birth to maturity. Retrovirology. 3, 18 (2006).
- Hartman, T. R., Qian, S., Bolinger, C., Fernandez, S., Schoenberg, D. R., Boris-Lawrie, K. RNA helicase A is necessary for translation of selected messenger RNAs. Nat.Struct.Mol.Biol. 13 (6), 509-516 (2006).
- Pullmann, R., et al. Analysis of turnover and translation regulatory RNA-binding protein expression through binding to cognate mRNAs. Mol.Cell.Biol. 27 (18), 6265-6278 (2007).
- Keene, J. D. RNA regulons: coordination of post-transcriptional events. Nat.Rev.Genet. 8 (7), 533-543 (2007).
- Moore, M. J. From birth to death: the complex lives of eukaryotic mRNAs. Science. 309 (5740), 1514-1518 (2005).
- Hassan, M. Q., Gordon, J. A., Lian, J. B., van Wijnen, A. J., Stein, J. L., Stein, G. S. Ribonucleoprotein immunoprecipitation (RNP-IP): a direct in vivo analysis of microRNA-targets. J.Cell.Biochem. 110 (4), 817-822 (2010).
- Selth, L. A., Close, P., Svejstrup, J. Q. Studying RNA-protein interactions in vivo by RNA immunoprecipitation. Methods Mol.Biol. 791, 253-264 (2011).
- Singh, D., Boeras, I., Singh, G., Boris-Lawrie, K. Isolation of Cognate Cellular and Viral Ribonucleoprotein Complexes of HIV-1 RNA Applicable to Proteomic Discovery and Molecular Investigations. Methods Mol.Biol. 1354, 133-146 (2016).
- Stake, M., et al. HIV-1 and two avian retroviral 5′ untranslated regions bind orthologous human and chicken RNA binding proteins. Virology. 486, 307-320 (2015).
- Sung, F. L., et al. Genome-wide expression analysis using microarray identified complex signaling pathways modulated by hypoxia in nasopharyngeal carcinoma. Cancer Lett. 253 (1), 74-88 (2007).
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat.Rev.Genet. 10 (1), 57-63 (2009).
- Michlewski, G., Caceres, J. F. RNase-assisted RNA chromatography. RNA. 16 (8), 1673-1678 (2010).
- Tacheny, A., Dieu, M., Arnould, T., Renard, P. Mass spectrometry-based identification of proteins interacting with nucleic acids. J. Proteomics. 94, 89-109 (2013).
- Duan, R., Sharma, S., Xia, Q., Garber, K., Jin, P. Towards understanding RNA-mediated neurological disorders. J.Genet.Genomics. 41 (9), 473-484 (2014).
- Butsch, M., Hull, S., Wang, Y., Roberts, T. M., Boris-Lawrie, K. The 5′ RNA terminus of spleen necrosis virus contains a novel posttranscriptional control element that facilitates human immunodeficiency virus Rev/RRE-independent Gag production. J. Virol. 73 (6), 4847-4855 (1999).
- Bolinger, C., et al. RNA helicase A interacts with divergent lymphotropic retroviruses and promotes translation of human T-cell leukemia virus type 1. Nucleic Acids Res. 35 (8), 2629-2642 (2007).
- Bolinger, C., Sharma, A., Singh, D., Yu, L., Boris-Lawrie, K. RNA helicase A modulates translation of HIV-1 and infectivity of progeny virions. Nucleic Acids Res. 38 (5), 1686-1696 (2010).
- Lee, T., et al. Suppression of the DHX9 helicase induces premature senescence in human diploid fibroblasts in a p53-dependent manner. J.Biol.Chem. 289 (33), 22798-22814 (2014).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal.Biochem. 72, 248-254 (1976).
- Glenn, G. Preparation of protein samples for mass spectrometry and N-terminal sequencing. Methods Enzymol. 536, 27-44 (2014).
- Keene, J. D., Komisarow, J. M., Friedersdorf, M. B. RIP-Chip: the isolation and identification of mRNAs, microRNAs and protein components of ribonucleoprotein complexes from cell extracts. Nat.Protoc. 1 (1), 302-307 (2006).
- Ranji, A., Shkriabai, N., Kvaratskhelia, M., Musier-Forsyth, K., Boris-Lawrie, K. Features of double-stranded RNA-binding domains of RNA helicase A are necessary for selective recognition and translation of complex mRNAs. J.Biol.Chem. 286 (7), 5328-5337 (2011).
