संकेतन प्रोटीन के समारोह की नक़ल करना: की ओर कृत्रिम संकेत पारगमन थेरेपी
Summary
We present guidelines for developing synthetic ‘chemical transducers’ that can induce communication between naturally unrelated proteins. In addition, detailed protocols are presented for synthesizing and testing a specific ‘transducer’ that enables a growth factor to activate a detoxifying enzyme and consequently, to regulate the cleavage of an anticancer prodrug.
Abstract
Signal transduction pathways, which control the response of cells to various environmental signals, are mediated by the function of signaling proteins that interact with each other and activate one other with high specificity. Synthetic agents that mimic the function of these proteins might therefore be used to generate unnatural signal transduction steps and consequently, alter the cell’s function. We present guidelines for designing ‘chemical transducers’ that can induce artificial communication between native proteins. In addition, we present detailed protocols for synthesizing and testing a specific ‘transducer’, which can induce communication between two unrelated proteins: platelet-derived growth-factor (PDGF) and glutathione-S-transferase (GST). The way by which this unnatural PDGF-GST communication could be used to control the cleavage of an anticancer prodrug is also presented, indicating the potential for using such systems in ‘artificial signal transduction therapy’. This work is intended to facilitate developing additional ‘transducers’ of this class, which may be used to mediate intracellular protein-protein communication and consequently, to induce artificial cell signaling pathways.
Introduction
संकेत पारगमन मार्ग लगभग हर सेलुलर प्रक्रिया में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं और सेल में तेजी से पर्यावरण के संकेतों पर प्रतिक्रिया करने की अनुमति देते हैं। 1 ये रास्ते अक्सर एक बाह्य रिसेप्टर, जो intracellular एंजाइमों के सक्रियण में परिणाम के लिए एक संकेत अणु के बंधन से शुरू हो रहे हैं। प्रवर्धन और सेल के भीतर इस संकेत के प्रसार प्रोटीन है कि प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत का एक नेटवर्क है जिसमें एंजाइमों reversibly उच्च विशिष्टता के साथ सक्रिय कर रहे हैं के रूप में संकेत के समारोह द्वारा मध्यस्थता है। क्योंकि इन नेटवर्कों का अनियंत्रण अक्सर कैंसर के विकास की ओर जाता है, वहाँ के कैंसर का संकेत पारगमन चिकित्सा ', 2 जिससे दवाओं घातक संकेत दे रास्ते को बाधित करने के लिए तैयार कर रहे हैं स्थापित करने में ज्यादा रुचि रही है। हमने हाल ही में पारगमन चिकित्सा कि दवाओं की क्षमता अप्राकृतिक संकेत पारगमन मार्ग उत्पन्न करने पर निर्भर करता संकेत करने के लिए एक वैकल्पिक दृष्टिकोण का प्रस्ताव किया है। <sup> 3 विशेष रूप से, हमें विश्वास है कि सिंथेटिक एजेंटों कि संकेत प्रोटीन के समारोह की नकल डिजाइन द्वारा, यह परोक्ष रूप से सेल के समारोह मिलाना संभव हो जाएगा। उदाहरण के लिए, इन कृत्रिम नेटवर्क एंजाइमों कि prodrugs फोड़ना सक्रिय करने के लिए प्रोटीन बायोमार्कर सक्षम हो सकता है। वैकल्पिक रूप से, इन संकेत प्रोटीन mimetics अप्राकृतिक सेल संकेत दे रास्ते को सक्रिय करने, चिकित्सीय प्रभाव में जिसके परिणामस्वरूप में सक्षम हो सकता है।
इस दृष्टिकोण की व्यवहार्यता को प्रदर्शित करने के लिए, हमने हाल ही में एक कृत्रिम 'रासायनिक ट्रांसड्यूसर' 4 कि glutathione-S-ट्रांसफेरेज़ (जीएसटी) है, जो सक्रिय द्वारा एक कैंसर विरोधी प्रोड्रग की दरार को गति प्रदान करने प्लेटलेट व्युत्पन्न वृद्धि कारक (PDGF) सक्षम बनाता बनाया है नहीं अपनी प्राकृतिक बाध्यकारी साथी। इस 'ट्रांसड्यूसर' की संरचना एक विरोधी PDGF डीएनए aptamer कि जीएसटी के लिए एक द्विसंयोजक अवरोध करनेवाला के साथ संशोधित किया गया है के होते हैं। इसलिए, इस सिंथेटिक एजेंट के लिए बाध्यकारी साइटों के साथ अणुओं के एक परिवार के अंतर्गत आता हैविभिन्न प्रोटीन, dimerization के 5-7 जैसे रासायनिक inducers (CIDs) 8-10 और भी oligonucleotide सिंथेटिक अणु conjugates के आधार पर प्रोटीन बाँधने के समूह के लिए। 11-21
ऐसी प्रणालियों के डिजाइन अंतर्निहित सामान्य सिद्धांतों यहाँ बताया जाता है और synthesizing और इस पारंपरिक एंजाइमी assays के साथ 'ट्रांसड्यूसर' के समारोह के परीक्षण के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान की जाती हैं। इस काम के अतिरिक्त इस वर्ग है, जो intracellular प्रोटीन, प्रोटीन संचार मध्यस्थता करने के लिए और इसके परिणामस्वरूप, कृत्रिम कोशिका संकेत दे रास्ते प्रेरित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है की 'ट्रांसड्यूसर' विकासशील की सुविधा के लिए करना है।
चित्रा 1 रेखाचित्र के रूप में सिंथेटिक 'रासायनिक ट्रांसड्यूसर' है कि अप्राकृतिक प्रोटीन, प्रोटीन संचार मध्यस्थता कर सकते हैं के ऑपरेटिंग सिद्धांतों का वर्णन है। इस चित्रण, एक 'रासायनिक ट्रांसड्यूसर' है, जो prot के लिए सिंथेटिक बाँधने को एकीकृत मेंEins मैं और द्वितीय (मैं और द्वितीय बाँधने), मैं प्रोटीन का उत्प्रेरक गतिविधि है, जो अपनी प्राकृतिक बाध्यकारी साथी नहीं है ट्रिगर करने के लिए प्रोटीन द्वितीय सक्षम बनाता है। प्रोटीन द्वितीय के अभाव में, ट्रांसड्यूसर एंजाइम (प्रोटीन मैं) का उत्प्रेरक साइट बांधता है और अपनी गतिविधि (चित्रा 1, राज्य ii) को रोकता है। प्रोटीन द्वितीय को 'ट्रांसड्यूसर' के बंधन, तथापि, बांधने की मशीन मैं और प्रोटीन द्वितीय की सतह (चित्रा 1, राज्य iii) है, जो, के प्रभावी एकाग्रता एक परिणाम के रूप में प्रोटीन आई की ओर अपने संबंध को कम करता है के बीच बातचीत को बढ़ावा देता है ' समाधान में 'मुफ्त ट्रांसड्यूसर कम हो जाता है, जो ट्रांसड्यूसर प्रोटीन की हदबंदी की ओर जाता रहा जटिल और प्रोटीन मैं के पुनर्सक्रियन (चित्रा 1, राज्य चतुर्थ)। साथ में ले ली, इन चरणों तीन मौलिक सिद्धांतों कुशल 'ट्रांसड्यूसर' का डिजाइन अंतर्निहित उजागर: (1) एक 'ट्रांसड्यूसर' एक विशिष्ट बांधने की मशीन प्रोटीन लक्ष्य से प्रत्येक के लिए, (2) बातचीत betwe होनी चाहिएएन बांधने की मशीन द्वितीय और प्रोटीन द्वितीय बांधने की मशीन मैं और प्रोटीन रहा है, और (3) बांधने की मशीन के बीच बातचीत मैं प्रोटीन द्वितीय की सतह के साथ बातचीत करने के लिए सक्षम होना चाहिए की तुलना में मजबूत होना चाहिए। यह पिछले सिद्धांत जरूरी है कि मैं अकेला बांधने की मशीन की आवश्यकता नहीं है एक उच्च आत्मीयता और प्रोटीन द्वितीय की ओर चयनात्मकता होगा। इसके बजाय, यह हमारे हाल के अध्ययनों से पता चला है कि एक प्रोटीन से निकटता में एक कृत्रिम अणु लाने इस अणु और प्रोटीन की सतह के बीच बातचीत को बढ़ावा देने की संभावना है पर आधारित है। 19,22,23
चित्रा 1:। 'रासायनिक ट्रांसड्यूसर' के ऑपरेटिंग सिद्धांतों 'रासायनिक ट्रांसड्यूसर' एक सक्रिय प्रोटीन मैं (राज्य i) से जोड़ा जाता है, यह अपनी सक्रिय साइट को बांधने की मशीन के माध्यम से मैं बांधता है और अपनी गतिविधि (राज्य ii) को रोकता है। प्रोटीन द्वितीय की उपस्थिति में, हालांकि, अनबाउंड 'रासायनिक टीransducer 'बांधने की मशीन द्वितीय, जो बांधने की मशीन मैं और प्रोटीन द्वितीय की सतह के बीच बातचीत को बढ़ावा देता है के माध्यम से प्रोटीन द्वितीय के साथ सूचना का आदान प्रदान। इस प्रेरित बांधने की मशीन मैं प्रोटीन द्वितीय बातचीत मैं जटिल और प्रोटीन के लिए मैं पुनर्सक्रियन (राज्य चतुर्थ)। बांधने की मशीन मैं के प्रभावी एकाग्रता, जो 'transducer' प्रोटीन की हदबंदी की ओर जाता है कम कर देता है यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
Protocol
Representative Results
Discussion
We presented a method for designing and testing of a ‘chemical transducer’ that can induce artificial communication between two naturally unrelated proteins, GST and PDGF, without modifying the native proteins. The unnatural GST-PDGF communications could be detected in real time by using enzymatic assays that follow the changes in the activity of GST in the presence of the ‘chemical transducer’ and increasing the concentrations of PDGF. In addition to detecting the activation of GST by PDGF, these assays were used to fol…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस शोध मिनर्वा फाउंडेशन, HFSP संगठन, और एक यूरोपीय अनुसंधान परिषद अनुदान द्वारा समर्थित किया गया (अनुदान 338,265 शुरू)।
Materials
| 1-chloro-2,4-dinitrobenzene | Sigma-Aldrich | 237329 | |
| Acetic acid | Bio Lab | 01070521 | |
| Acetnitrile | J.T.Baker | 9017-03 | |
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4544 | |
| Copper(II) Sulfate pentahydrate | Merck-Millipore | 102790 | |
| Dimethyl sulfoxide | Merck-Millipore | 802912 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Biological Industries | 02-023-5A | |
| Ethacrynic acid | Tokyo Chemical Industry Co. Ltd | E0526 | |
| Glutathione-s-transferase M1-1 | Israel Structural Proteomics Center (Weizmann Institute of Science, Rehovot, Israel) | ||
| JS-K | Sigma-Aldrich | J4137 | |
| L-glutathione reduced | Sigma-Aldrich | G4251 | |
| Magnesium Chloride | J.T.Baker | 0162 | |
| nitrate/nitrite colorimetric assay kit | Cayman Chemical | 780001 | |
| Oligonucleotides | W. M. Keck Foundation Biotechnology at Yale University | custom order | |
| PDGF-BB | Israel Structural Proteomics Center (Weizmann Institute of Science, Rehovot, Israel) | ||
| TBTA | Sigma-Aldrich | 678937 | |
| Triethylamine | Sigma-Aldrich | T0886 | |
| Desalting column | GE Healthcare | illustra MicroSpin G-25 Columns | |
| HPLC | Waters | 2695 separation module | |
| HPLC column | Waters | XBridgeTM OST C18 column (2.5 μM, 4.6 mm × 50 mm) | |
| HPLC column | Waters | XBridgeTM OST C18 column (2.5μM, 10 mm × 50 mm) | |
| Plate reader | BioTek | synergy H4 hybrid |
References
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