Micro-fabricated devices integrated with fluidic components provide an in vitro platform for cell studies mimicking the in vivo micro-environment. We developed polymethylmethacrylate-based microfluidic chips for studying cellular responses under single or coexisting chemical/electrical/shear stress stimuli.
Mikrofluidenheder er i stand til at skabe en præcis og styrbar cellulære mikromiljø af pH, temperatur, saltkoncentration og andre fysiske eller kemiske stimuli. De er blevet almindeligt anvendt til in vitro celle-studier ved at tilvejebringe in vivo som omgivelserne. Især hvordan celler respons til kemiske gradienter, elektriske felter, og spændinger shear har trukket mange interesser, eftersom disse fænomener er vigtige i forståelsen cellulære egenskaber og funktioner. Disse mikrofluide chips kan være fremstillet af glassubstrater, silicium wafers, polydimethylsiloxan (PDMS) polymerer, polymethylmethacrylat (PMMA) substrater, eller polyethylenterephthalat (PET) substrater. Ud af disse materialer, PMMA substrater er billige og kan let bearbejdes ved hjælp af laser ablation og skrivning. Selv om et par mikrofluidenheder er designet og fremstillet til at generere flere, sameksisterende kemiske og elektriske stimuli, blev ingen af dem betragteseffektiv nok til at reducere eksperimentelle gentagelser, især til screeningsformål. I denne rapport beskriver vi vores design og fabrikation af to PMMA-baserede mikrofluide chips til at undersøge cellulære reaktioner, i produktionen af reaktive ilt arter og migration, under en enkelt eller sameksisterende kemiske / elektriske / shear stress stimuli. Den første chip genererer fem relative koncentrationer på 0, 1/8, 1/2, 7/8 og 1 i kulturen regioner, sammen med en forskydningsspænding gradient produceret i hvert af disse områder. Den anden chip genererer de samme relative koncentrationer, men med fem forskellige elektriske feltstyrker oprettet inden hver kultur-området. Disse anordninger ikke kun give celler med en præcis, kontrollerbar mikromiljø men også i høj grad øge den eksperimentelle gennemløb.
In vivo-celler er omgivet af en række forskellige biomolekyler herunder ekstracellulære matrix (ECM), carbohydrater, lipider og andre celler. De funktionalisere ved at reagere på mikro-miljø stimuli såsom vekselvirkninger med ECM og svar på kemiske gradienter af forskellige vækstfaktorer. Traditionelt er in vitro celle undersøgelser udført i celle dyrkningsskåle hvor forbruget af celler og reagenser er stort og celler vokser i en statisk (ikke-cirkulerende) miljø. For nylig har mikro-fabrikerede enheder integreret med fluidkomponenterne forudsat en alternativ platform for celle studier i en mere kontrollerbar måde. Sådanne indretninger er i stand til at skabe en præcis mikromiljø af kemiske og fysiske stimuli og samtidig minimere forbruget af celler og reagenser. Disse mikrofluide chips kan være fremstillet af glassubstrater, silicium wafers, polydimethylsiloxan (PDMS) polymerer, polymethylmethacrylat (PMMA) substrater, eller polyethyleneterephthalat (PET) substrater 1-3. PDMS-baserede enheder er gennemsigtige, biokompatible, og permeabel for gasser, hvilket gør dem egnede til langvarig cellekultur og undersøgelser. PMMA og PET substrater er billig og let at blive bearbejdet ved hjælp af laser ablation og skrivning.
Mikrofluidenheder bør give celler med en stabil og kontrollerbar mikro-miljø, hvor cellerne er underlagt forskellige kemiske og fysiske stimuli. For eksempel er mikrofluide chips anvendes til at studere kemotaksi af celler. I stedet for traditionelle metoder, der beskæftiger Boyden kammer og kapillar 4,5 disse miniaturiserede fluide enheder kan generere præcise kemiske gradienter for at studere cellernes adfærd 1,6,7. Et andet eksempel er at studere cellernes retningsbestemt migration under elektriske felter EFS (), et fænomen opkaldt electrotaxis. Electrotactic adfærd af celler blev rapporteret at være relateret til nerve regenerering 8, fosterudvikling 9,og sårheling 10,11. Og mange undersøgelser er blevet udført for at undersøge electrotaxis af forskellige celletyper, herunder kræftceller 12,13, lymfocytter 14,15, leukæmi celler 11, og stamceller 16. Konventionelt petriskåle, og dækglas anvendes til at konstruere electrotactic kamre til generering elementærfiler 17. Sådanne simple opsætninger give problemer medium fordampning og upræcise elementærfiler, men de kan overvindes ved mikrofluidenheder af lukkede, veldefinerede fluide kanaler 12,18,19.
At systematisk studere cellulære responser under præcise, kontrollerbare kemiske og elektriske stimuli, ville det være til stor nytte for at udvikle mikrofluidenheder kan levere celler med flere stimuli på samme tid. For eksempel Li et al. rapporterede en PDMS-baserede mikrofluidanordning for at skabe en enkelt eller sameksisterende kemiske gradienter og elementærfiler 20. Kao et al. devstak en lignende mikrofluid chip til at modulere kemotaksi af lungekræft celler ved elementærfiler 6. Endvidere at øge throughput, Hou et al. designet og fabrikeret en PMMA-baserede multikanal-dual-elektrisk-felt chip til at give celler med 8 forskellige kombinerede stimuli, bliver (2 EFs styrker x 4 kemiske koncentrationer) 21. For yderligere at øge hele og tilføje forskydningsspændingen stimulus, vi udviklet to PMMA-baserede mikrofluidenheder til undersøgelse cellulære reaktioner under enkelt- eller sameksisterende kemiske / elektriske / shear stress stimuli.
Rapporteret af Lo et al. 22,23, disse enheder indeholder fem uafhængige cellekultur-kanaler er underlagt kontinuerlig fluidisk flyder, efterligner in vivo kredsløbssygdomme. I den første chip (den kemisk-forskydningsspænding chip eller CSS chip), fem relative koncentrationer af 0, 1/8, 1/2, 7/8 og 1 frembringes i kulturen regioner, og en forskydningsspænding gradient er produced inde i hver af de fem kulturområder. I den anden chip (den kemisk-elektriske felt chip eller CEF chip), ved hjælp af et enkelt sæt af elektroder og 2 sprøjtepumper, er fem ELEMENTÆRFILEN styrker genereret ud over fem forskellige kemiske koncentrationer inden disse kulturområder. Numeriske beregninger og simuleringer udføres for at bedre design og drive disse chips, og lungekræft celler dyrket inde i disse indretninger er genstand for enkelt- eller samtidig eksisterende stimuli til observation deres svar med hensyn til produktion af reaktive oxygenarter (ROS), vandringshastigheden, og migrationen retning. Disse chips er vist sig at være tidsbesparende, high-throughput og pålidelige enheder for at undersøge, hvordan cellerne reagerer på forskellige mikro-miljømæssige stimuli.
PMMA-baserede chips er fremstillet ved hjælp af laser ablation og skrivning, som er billigere og lettere metoder i forhold til PDMS-baserede chips, som kræver mere kompliceret blød litografi. Efter at designe en mikrofluid chip, kan fremstilling og samling ske inden for blot 5 min. Der er nogle kritiske trin, der skal betales opmærksomhed i at udføre eksperimentet. Den første er "samle" spørgsmål. Adapterne skal limes korrekt til det øverste lag af chippen. Lim kan lække ind i de strømningstekniske …
The authors have nothing to disclose.
This work was financially supported by the Ministry of Science and Technology of Taiwan under Contract No. MOST 104-2311-B-002-026 (K. Y. Lo), No. MOST 104-2112-M-030-002 (Y. S. Sun), and National Taiwan University Career Development Project (103R7888) (K. Y. Lo). The authors also thank the Center for Emerging Material and Advanced Devices, National Taiwan University, for the use of the cell culture room.
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11965-092 | Cell culture medium |
Trypsin | Gibco | 25300-054 | detach cell from the dish |
Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10082147 | Cell culture medium |
10-cm cell culture Petri dish | Nunc | 150350 | Cell culture |
Bright-Line Hemacytometer | Sigma | Z359629 | Cell Counting Equipment |
PMMA | Customized | Customized | Microfluidic chip |
Adaptor | Customized | Customized | Microfluidic chip |
0.07/0.22 mm double-sided tape | 3M | 8018/9088 | Microfluidic chip |
Low melting point agarose | Sigma | A9414 | Salt bridge |
2'-7'-dichlorodihydrofluoresce diacetate | Sigma | D6883 | Intracellular ROS measurement |
Indium tin oxide (ITO) glass | Merck | 300739 | Heater |
Proportional-integral-derivative controller | JETEC Electronics Co. | TTM-J4-R-AB | Temperature controller |
Thermal coupler | TECPEL | TPK-02A | Temperature controller |
CO2 laser scriber | Laser Tools & Technics Corp. | ILS2 | Microfluidic chip fabrication |
Syringe pumps | New Era | NE-300 | Pumping medium and chemicals into the chip |
Power supply | Major Science | MP-300V | Supplying direct currents |
Inverted microscope | Olympus | CKX41 | Monitoring cell migration |
Inverted fluorescent microscope | Nikon | TS-100 | Monitoring cell migartion and fluorescencent signals |
DSLR camera | Canon | 60D | Recording bright-field images |
CCD camera | Nikon | DS-Qi1 | Recording fluorescent images |
super glue | 3M Scotch | 7004 | Attaching adaptors to PMMA substrates |
AutoCAD | Autodesk Inc. | Designing microfluidic chips | |
DMSO | Sigma | D8418 | Dissolving DCFDA |
ImgeJ | National Institutes of Health | Quantifying fluorescent intensities and cell migration |