Micro-fabricated devices integrated with fluidic components provide an in vitro platform for cell studies mimicking the in vivo micro-environment. We developed polymethylmethacrylate-based microfluidic chips for studying cellular responses under single or coexisting chemical/electrical/shear stress stimuli.
Microfluïdische inrichtingen zijn in staat om een nauwkeurige en controleerbare cellulaire micromilieu van pH, temperatuur, zoutconcentratie, en andere fysische of chemische stimuli. Ze werden gebruikt voor in vitro studies cellen door in vivo als omgeving. Vooral hoe cellen reactie op chemische gradiënten, elektrische velden, en schuifspanningen heeft veel belangen getrokken omdat deze verschijnselen zijn belangrijk bij het begrijpen van de cellulaire eigenschappen en functies. Deze microfluïdische chips kunnen worden vervaardigd uit glassubstraten, silicium wafers, polydimethylsiloxaan (PDMS) polymeren, polymethylmethacrylaat (PMMA) substraten, of polyethyleentereftalaat (PET) substraten. Uit deze materialen, PMMA substraten zijn goedkoop en kunnen gemakkelijk worden verwerkt met behulp van laser ablatie en schrijven. Hoewel enkele microfluïdische inrichtingen zijn ontworpen en vervaardigd voor het genereren van meerdere, naast elkaar bestaande chemische en elektrische stimuli, was geen van hen beschouwdvoldoende op het verminderen experimentele herhalingen, vooral voor screeningsdoeleinden. In dit rapport beschrijven we ons ontwerp en de fabricage van twee-PMMA gebaseerde microfluïdische chips voor het onderzoeken van cellulaire reacties, in de productie van reactieve zuurstofverbindingen en de migratie, onder één of samenleven chemische / elektrische / shear stress stimuli. De eerste chip genereert vijf relatieve concentraties van 0, 1/8, 1/2, 7/8 en 1 in de kweek regio, samen met een afschuifspanning gradiënt geproduceerd in elk van deze gebieden. De tweede chip genereert dezelfde relatieve concentraties, maar met vijf verschillende elektrische veldsterkte gecreëerd binnen elke cultuur gebied. Deze apparaten bieden niet alleen cellen met een nauwkeurige, controleerbare micro-omgeving, maar ook de experimentele throughput sterk toenemen.
In vivo cellen zijn omgeven door een verscheidenheid aan biomoleculen waaronder extracellulaire matrix (ECM), koolhydraten, lipiden en andere cellen. Ze functionaliseren door te reageren op micro-prikkels uit de omgeving, zoals de interactie met ECM en de reacties op de chemische gradiënten van verschillende groeifactoren. Traditioneel worden in vitro cel studies bij celcultuurschalen wanneer de consumptie van cellen en reagentia is groot en cellen groeien in een statische (niet-circulerende) omgeving. Onlangs, micro-gefabriceerde apparaten geïntegreerd met vloeibare componenten hebben verstrekt een alternatief platform voor mobiele studies op een meer beheersbare manier. Dergelijke inrichtingen zijn in staat om een nauwkeurige micromilieu van chemische en fysische stimuli met een minimaal verbruik van cellen en reagentia. Deze microfluïdische chips kunnen worden vervaardigd uit glassubstraten, silicium wafers, polydimethylsiloxaan (PDMS) polymeren, polymethylmethacrylaat (PMMA) substraten of polyethylenetereftalaat (PET) substraten 1-3. PDMS-apparaten zijn transparant, biocompatibel en doorlaatbaar voor gassen, waardoor ze geschikt zijn voor langdurige celcultuur en studies. PMMA en PET substraten zijn goedkoop en gemakkelijk te verwerken met behulp van laser ablatie en schrijven.
Microfluïdische inrichtingen moeten de cellen te voorzien van een stabiele en controleerbare micro-omgeving waarin cellen zijn onderworpen aan verschillende chemische en fysische stimuli. Zo worden microfluïdische chips chemotaxis van cellen te bestuderen. In plaats van de traditionele methoden die in dienst Boyden kamer en capillaire 4,5 deze geminiaturiseerde fluïde apparaten kunnen precieze chemische gradiënten genereren voor het bestuderen van de cellen 'gedrag 1,6,7. Een ander voorbeeld is het directional migratie cellen onder elektrische velden (EF), een fenomeen genaamd electrotaxis bestuderen. Electrotactic gedrag cellen werd gerapporteerd als zijnde gerelateerd aan zenuwregeneratie 8, 9 embryonale ontwikkeling,en wondgenezing 10,11. En veel studies uitgevoerd om de electrotaxis van verschillende celtypen waaronder kankercellen 12,13 onderzoeken lymfocyten 14,15 leukemiecellen 11 en stamcellen 16. Conventioneel, Petrischalen en dekglaasjes worden gebruikt om electrotactic kamers te bouwen voor het opwekken van EF 17. Dergelijke eenvoudige opstellingen problemen opleveren van middelgrote verdamping en onnauwkeurig EF, maar ze kunnen worden overwonnen door microfluïdische apparaten omheind, goed gedefinieerde vloeibare kanalen 12,18,19.
Systematisch bestuderen cellulaire reacties onder nauwkeurig regelbare chemische en elektrische stimuli, zou het van groot nut microfluïdische inrichtingen staat om cellen met meerdere stimuli tegelijkertijd ontwikkelen. Bijvoorbeeld Li et al. rapporteerde een PDMS-gebaseerde microfluïdische apparaat voor het maken van één of naast elkaar bestaande chemische gradiënten en EF 20. Kao et al. devweggelopen een soortgelijke microfluïdische chip met de chemotaxis van longkanker cellen te moduleren door EF 6. Bovendien zou de doorvoersnelheid, Hou et al verhogen. ontworpen en gefabriceerd een PMMA multichannel-dual-elektrische veld chip om cellen te voorzien van 8 verschillende gecombineerde stimuli, zijnde (2 EF sterktes x 4 chemische concentraties) 21. Om de hele verdere versterking van de en voeg de shear stress stimulus, ontwikkelden we twee PMMA gebaseerde microfluïdische apparaten voor het bestuderen van cellulaire reacties onder één of samenleven chemische / elektrische / shear stress stimuli.
Gerapporteerd door Lo et al. 22,23, deze apparaten bevatten vijf onafhankelijke celkweek kanalen onderworpen aan continue vloeibare vloeiende, het nabootsen van de in vivo bloedsomloop. In de eerste chip (de chemische-shear stress chip of de CSS-chip), vijf relatieve concentraties van 0, 1/8, 1/2, 7/8 en 1 worden gegenereerd in de cultuur regio's, en een shear stress gradiënt produced in elk van de vijf gebieden cultuur. In de tweede chip (de chemische-elektrische veld chip of de CEF chip), met behulp van een enkele set van elektroden en 2 spuitpompen worden vijf EF krachten gegenereerd in aanvulling op vijf verschillende chemische concentraties binnen deze cultuur gebieden. Numerieke berekeningen en simulaties worden uitgevoerd om een beter ontwerp en functioneren deze chips en longkankercellen gekweekt binnen deze hulpmiddelen onder één of bestaande stimuli waarnemersregeling antwoorden voor de productie van reactieve zuurstofsoorten (ROS), de migratiesnelheid, en de migratie richting. Deze chips worden aangetoond tijdbesparende, high-throughput en betrouwbare apparatuur voor het onderzoeken hoe cellen reageren op de verschillende micro-prikkels uit de omgeving zijn.
PMMA-gebaseerde chips worden gemaakt door laserablatie en schrijven die goedkoper en gemakkelijker methoden zijn vergeleken met PDMS-gebaseerde chips ingewikkelder zachte lithografie vereist. Na het ontwerpen van een microfluïdische chip, kan de fabricage en assemblage worden gedaan binnen slechts 5 minuten. Er zijn een aantal kritische stappen die de aandacht moet worden besteed aan het uitvoeren van het experiment. De eerste is de "assembleren" kwestie. De adapters moet goed worden vastgelijmd aan de bovens…
The authors have nothing to disclose.
This work was financially supported by the Ministry of Science and Technology of Taiwan under Contract No. MOST 104-2311-B-002-026 (K. Y. Lo), No. MOST 104-2112-M-030-002 (Y. S. Sun), and National Taiwan University Career Development Project (103R7888) (K. Y. Lo). The authors also thank the Center for Emerging Material and Advanced Devices, National Taiwan University, for the use of the cell culture room.
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11965-092 | Cell culture medium |
Trypsin | Gibco | 25300-054 | detach cell from the dish |
Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10082147 | Cell culture medium |
10-cm cell culture Petri dish | Nunc | 150350 | Cell culture |
Bright-Line Hemacytometer | Sigma | Z359629 | Cell Counting Equipment |
PMMA | Customized | Customized | Microfluidic chip |
Adaptor | Customized | Customized | Microfluidic chip |
0.07/0.22 mm double-sided tape | 3M | 8018/9088 | Microfluidic chip |
Low melting point agarose | Sigma | A9414 | Salt bridge |
2'-7'-dichlorodihydrofluoresce diacetate | Sigma | D6883 | Intracellular ROS measurement |
Indium tin oxide (ITO) glass | Merck | 300739 | Heater |
Proportional-integral-derivative controller | JETEC Electronics Co. | TTM-J4-R-AB | Temperature controller |
Thermal coupler | TECPEL | TPK-02A | Temperature controller |
CO2 laser scriber | Laser Tools & Technics Corp. | ILS2 | Microfluidic chip fabrication |
Syringe pumps | New Era | NE-300 | Pumping medium and chemicals into the chip |
Power supply | Major Science | MP-300V | Supplying direct currents |
Inverted microscope | Olympus | CKX41 | Monitoring cell migration |
Inverted fluorescent microscope | Nikon | TS-100 | Monitoring cell migartion and fluorescencent signals |
DSLR camera | Canon | 60D | Recording bright-field images |
CCD camera | Nikon | DS-Qi1 | Recording fluorescent images |
super glue | 3M Scotch | 7004 | Attaching adaptors to PMMA substrates |
AutoCAD | Autodesk Inc. | Designing microfluidic chips | |
DMSO | Sigma | D8418 | Dissolving DCFDA |
ImgeJ | National Institutes of Health | Quantifying fluorescent intensities and cell migration |