Entwerfen Mikrofluidiksysteme für ein Studium zellulären Reaktionen Unter Einzel- oder Coexisting Chemie / Elektro / Schubspannung Stimuli
Summary
Micro-fabricated devices integrated with fluidic components provide an in vitro platform for cell studies mimicking the in vivo micro-environment. We developed polymethylmethacrylate-based microfluidic chips for studying cellular responses under single or coexisting chemical/electrical/shear stress stimuli.
Abstract
Mikrofluidik-Vorrichtungen sind in der Lage eine präzise und steuerbare zelluläre Mikroumgebung von pH-Wert, Temperatur, Salzkonzentration und andere physikalische oder chemische Stimuli zu schaffen. Sie wurden durch die Bereitstellung in vivo wie Umgebung für de – vitro – Zellstudien verwendet. Vor allem, wie Zellen als Reaktion auf chemische Gradienten, elektrische Felder und Scherspannungen hat viele Interessen gezogen, da diese Phänomene sind wichtig bei der zellulären Eigenschaften und Funktionen zu verstehen. Diese mikrofluidischen Chips von Glassubstraten, Siliciumwafern, Polydimethylsiloxan (PDMS) Polymere, Polymethylmethacrylat (PMMA) -Substraten oder Polyethylenterephthalat (PET) -Substraten hergestellt werden. Aus diesen Materialien sind PMMA-Substrate billig und leicht verarbeitet werden können Laserablation und Schreiben verwenden. Obwohl einige mikrofluidischen Vorrichtungen konstruiert und hergestellt mehrere zur Erzeugung koexistierenden chemische und elektrische Reize, keiner von ihnen wurde alseffizient genug experimentellen Wiederholungen bei der Reduzierung, insbesondere für Screening-Zwecke. In diesem Bericht beschreiben wir unsere Konstruktion und Herstellung von zwei PMMA-Basis mikrofluidischen Chips für zelluläre Reaktionen zu untersuchen, bei der Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies und die Wanderung, die unter Ein- oder koexistieren chemisch / Elektro / Schubspannung Reize. Der erste Chip erzeugt fünf relativen Konzentrationen von 0, 1/8, 1/2, 7/8, und 1 in den Kulturbereichen zusammen mit einer Scherspannungsgefälle innerhalb jeder dieser Bereiche erzeugt. Der zweite Chip erzeugt die gleichen relativen Konzentrationen, aber mit fünf verschiedenen elektrischen Feldstärken innerhalb jeder Kulturbereich geschaffen. Diese Geräte bieten nicht nur Zellen mit einer präzisen, steuerbaren Mikroumgebung, sondern auch stark die experimentellen Durchsatz zu erhöhen.
Introduction
In vivo – Zellen werden durch eine Vielzahl von Biomolekülen , einschließlich der extrazellulären Matrix (ECM), Kohlehydraten, Lipiden und anderen Zellen umgeben. Sie funktionalisieren durch Mikro-Umweltreize wie Wechselwirkungen mit ECM und Antworten auf chemische Gradienten verschiedener Wachstumsfaktoren reagieren. Herkömmlicherweise werden in vitro – Zellstudien in Zellkulturschalen durchgeführt , wobei der Verbrauch von Zellen und Reagenzien groß ist und die Zellen wachsen in einem statischen (nicht zirkulierende) -Umgebung. Vor kurzem Mikro hergestellten integrierten Geräte mit fluidische Komponenten haben eine alternative Plattform für Zellstudien in kontrollierbarer Weise zur Verfügung gestellt. Solche Vorrichtungen sind in der Lage eine genaue Mikroumgebung von chemischen und physikalischen Stimuli zu schaffen, während der Verbrauch von Zellen und Reagenzien zu minimieren. Diese mikrofluidischen Chips von Glassubstraten, Siliciumwafern, Polydimethylsiloxan (PDMS) Polymere, Polymethylmethacrylat (PMMA) Substraten hergestellt werden oder polyethyleneterephthalat (PET) Substrate 1-3. PDMS-basierte Geräte sind transparent, biokompatibel und für Gase durchlässig, so dass sie geeignet für die Langzeitzellkultur und Studien zu machen. PMMA und PET-Substrate sind billig und einfach zu verarbeiten sind Laserablation und Schreiben verwenden.
Mikrofluidik-Vorrichtungen sollten die Zellen mit einer stabilen und steuerbaren Mikroumgebung bereitzustellen, wo Zellen ausgesetzt sind unterschiedliche chemische und physikalische Reize. Beispielsweise werden Mikrofluidik-Chips verwendet, die Chemotaxis von Zellen zu untersuchen. Statt der traditionellen Methoden , die Boyden – Kammer und Kapillare 4,5 Diese miniaturisierten Fluidikvorrichtungen präzise chemische Gradienten verwenden für 1,6,7 Zellen 'Verhalten zu studieren erzeugen kann. Ein anderes Beispiel ist, Zellen 'gerichtete Migration unter elektrischen Feldern (EFS), ein Phänomen namens electro zu studieren. Electrotactic Verhalten von Zellen berichtet 8, 9 Embryonalentwicklung zur Nervenregeneration verbunden zu sein,und Wund 10,11 heilen. Und viele Studien durchgeführt wurden 12,13 die electro verschiedener Zelltypen , einschließlich Krebszellen zu untersuchen, Lymphozyten 14,15, Leukämiezellen 11, und Stammzellen 16. Herkömmlicherweise werden Petrischalen und Deckgläser verwendet für electrotactic Kammern zu bauen EFs zu erzeugen 17. Solche einfachen Setups stellen Probleme mittlerer Verdunstung und ungenau EFs, aber sie können von mikrofluidischen Vorrichtungen eingeschlossen, gut definierte fluidische Kanäle 12,18,19 überwunden werden.
Um systematisch zelluläre Reaktionen unter präzise steuerbare chemische und elektrische Reize hat, wäre es von großem Nutzen sein, um mikrofluidische Geräte entwickeln, die Zellen mit mehreren Stimuli zugleich bietet. Beispielsweise Li et al. berichteten 20 ein PDMS-basierte Mikrofluidik – Vorrichtung ein- oder koexistieren chemische Gradienten und EFs für die Erstellung. Kao et al. developed eine ähnliche Mikrofluidik – Chip 6 die Chemotaxis von Lungenkrebszellen durch EFs zu modulieren. Darüber hinaus ist der Durchsatz, Hou et al zu erhöhen. entwickelt und gefertigte Chip eine PMMA-basierten Multichannel-Dual-elektrischen Feld Zellen mit 8 verschiedenen kombinierten Reize zu bieten, wobei (2 EF Stärken x 4 chemischen Konzentrationen) 21. Um die gesamten erhöhen und die Schubspannung Reiz hinzufügen, entwickelten wir zwei PMMA-Basis mikrofluidischen Vorrichtungen zur Untersuchung von zellulären Reaktionen unter Einzel- oder koexistieren chemisch / Elektro / Schubspannung Reize.
Berichtet von Lo et al. 22,23, diese Geräte enthalten fünf unabhängige Zellkultur Kanäle unterliegt einer ständigen fluidischen fließende, die in vivo – Kreislauf – System nachahmt. In dem ersten Chip (chemisch-Scherspannung Chip oder dem CSS-Chip), fünf relativen Konzentrationen von 0, 1/8, 1/2, 7/8 und 1 sind in den Kulturbereichen erzeugt wird, und einer Scherspannungsgefälle ist produced innerhalb jedes der fünf Kulturbereichen. In dem zweiten Chip (der chemisch-elektrischen Feldes Chip oder dem CEF-Chip), durch einen einzigen Satz von Elektroden und zwei Spritzenpumpen verwendet wird, werden fünf EF Stärken neben fünf verschiedenen chemischen Konzentrationen innerhalb dieser Kulturbereichen erzeugt. Numerische Berechnungen und Simulationen sind besseres Design durchgeführt, und arbeiten diese Chips und Lungenkrebszellen innerhalb dieser Vorrichtungen kultiviert unterliegen Einfach- oder koexistierenden Stimuli für ihre Antworten in Bezug auf die Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) zu beobachten, die Migrationsrate, und die Wanderungsrichtung. Diese Chips werden demonstriert werden zeitsparend mit hohem Durchsatz und zuverlässige Geräte für die Untersuchung, wie Zellen auf verschiedene Mikro-Umweltreize reagieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
PMMA-Basis-Chips werden unter Verwendung von Laserablation und Schreiben hergestellt, die sind billiger und einfacher Methoden im Vergleich zu PDMS-basierten Chips, die komplizierter Weich-Lithographie erfordern. Nach einem mikrofluidischen Chip entwerfen, können die Fertigung und Montage innerhalb von nur 5 Minuten durchgeführt werden. Es gibt einige wichtige Schritte, dass darauf zu achten, sollte das Experiment durchführen. Die erste ist die "Montage" -Ausgabe. Die Adapter sollten richtig an die oberste …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was financially supported by the Ministry of Science and Technology of Taiwan under Contract No. MOST 104-2311-B-002-026 (K. Y. Lo), No. MOST 104-2112-M-030-002 (Y. S. Sun), and National Taiwan University Career Development Project (103R7888) (K. Y. Lo). The authors also thank the Center for Emerging Material and Advanced Devices, National Taiwan University, for the use of the cell culture room.
Materials
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11965-092 | Cell culture medium |
| Trypsin | Gibco | 25300-054 | detach cell from the dish |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10082147 | Cell culture medium |
| 10-cm cell culture Petri dish | Nunc | 150350 | Cell culture |
| Bright-Line Hemacytometer | Sigma | Z359629 | Cell Counting Equipment |
| PMMA | Customized | Customized | Microfluidic chip |
| Adaptor | Customized | Customized | Microfluidic chip |
| 0.07/0.22 mm double-sided tape | 3M | 8018/9088 | Microfluidic chip |
| Low melting point agarose | Sigma | A9414 | Salt bridge |
| 2'-7'-dichlorodihydrofluoresce diacetate | Sigma | D6883 | Intracellular ROS measurement |
| Indium tin oxide (ITO) glass | Merck | 300739 | Heater |
| Proportional-integral-derivative controller | JETEC Electronics Co. | TTM-J4-R-AB | Temperature controller |
| Thermal coupler | TECPEL | TPK-02A | Temperature controller |
| CO2 laser scriber | Laser Tools & Technics Corp. | ILS2 | Microfluidic chip fabrication |
| Syringe pumps | New Era | NE-300 | Pumping medium and chemicals into the chip |
| Power supply | Major Science | MP-300V | Supplying direct currents |
| Inverted microscope | Olympus | CKX41 | Monitoring cell migration |
| Inverted fluorescent microscope | Nikon | TS-100 | Monitoring cell migartion and fluorescencent signals |
| DSLR camera | Canon | 60D | Recording bright-field images |
| CCD camera | Nikon | DS-Qi1 | Recording fluorescent images |
| super glue | 3M Scotch | 7004 | Attaching adaptors to PMMA substrates |
| AutoCAD | Autodesk Inc. | Designing microfluidic chips | |
| DMSO | Sigma | D8418 | Dissolving DCFDA |
| ImgeJ | National Institutes of Health | Quantifying fluorescent intensities and cell migration |
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