단일 또는 공존 화학 / 전기 / 전단 응력 자극에서 세포 응답 유학을위한 미세 유체 장치 설계
Summary
Micro-fabricated devices integrated with fluidic components provide an in vitro platform for cell studies mimicking the in vivo micro-environment. We developed polymethylmethacrylate-based microfluidic chips for studying cellular responses under single or coexisting chemical/electrical/shear stress stimuli.
Abstract
미세 유체 장치의 pH, 온도, 염농도, 다른 물리적 또는 화학적 자극을 정밀하고 제어 가능한 세포 미세 환경을 조성 할 수있다. 이들은 일반적으로 주변 같은 생체 내에서 제공하여 시험 관내 세포의 연구를 위해 사용되어왔다. 이러한 현상은 세포의 특성과 기능을 이해하는데 중요하기 때문에 특히, 세포가 화학 그라디언트, 전기 필드 및 전단 응력에 대응하여 얼마나 많은 관심을 받고있다. 이 마이크로 유체 칩은 유리 기판, 실리콘 웨이퍼, 폴리 디메틸 실록산 (PDMS) 중합체, 폴리 메틸 메타 크릴 레이트 (PMMA) 기판, 폴리에틸렌 테레 프탈레이트 (PET) 기판에 제작 될 수있다. 이들 재료 중에서, PMMA 기판을 저렴하고 간편하게 레이저 어블 및 기입을 사용하여 처리 될 수있다. 몇 마이크로 유체 장치는 다수의 화학 물질을 생성하는 전기 자극을 공존 설계 및 제작 하였지만, 이들 중 어느 것도 고려되지 않았다충분히 목적을 선별 특히 실험적인 반복을 감소 시키는데 효율적입니다. 이보고에서는, 단일 또는 공존 화학적 / 전기적 / 전단 스트레스 자극에 따라, 반응성 산소 종의 생산 및 마이그레이션에, 세포 반응을 조사하는 두 PMMA 계 미세 유체 칩 우리의 설계 및 제작을 설명한다. 첫 번째 칩은 다섯 상대 농도를 생성 0, 1/8, 함께 각 영역 내에서 생산되는 전단 응력 구배와 문화 지역에서 1/2, 7/8, 1,. 두 번째 칩은 있지만, 각 문화 영역 내에서 생성 된 다섯 가지의 전계 강도와 같은 상대적으로 농도를 생성합니다. 이러한 장치는 정확하고 제어 가능한 마이크로 – 셀 환경을 제공 할뿐만 아니라, 매우 실험 처리량을 증가시키지.
Introduction
생체 내 세포 외 기질 (ECM), 탄수화물, 지질 및 기타 생체 세포를 포함하는 다양한 둘러싸여있다. 그들은 각종 성장 인자의 화학 그라디언트에 ECM과의 상호 작용 및 응답으로 마이크로 환경 자극에 반응하여 기능화. 세포 및 시약의 소비가 크고 세포 환경 (비순환) 고정 성장할 여기서 전통적으로, 시험 관내 세포 연구 세포 배양 접시에서 수행된다. 최근, 유체 구성 요소와 통합 마이크로 제조 장치는 더 많은 제어 방식으로 세포 연구에 대한 대안 플랫폼을 제공하고 있습니다. 이러한 장치는 세포 및 시약의 소비를 최소화하면서 화학적 및 물리적 자극의 정확한 미세 환경을 조성 할 수있다. 이 마이크로 유체 칩은 유리 기판, 실리콘 웨이퍼, 폴리 디메틸 실록산 제조 될 수있다 (PDMS) 중합체, 폴리 메틸 메타 크릴 레이트 (PMMA) 기재 또는 polyethylenetere프탈레이트 (PET)를 1-3 기판들. PDMS 기반 디바이스는 장기간 세포 배양 및 연구에 적합하게 투명 생체 적합성 및 기체 투과성이다. PMMA 및 PET 기판을 레이저 제거와 쓰기를 사용하여 처리 할 저렴하고 쉽습니다.
미세 유체 장치는 세포가 서로 다른 화학적, 물리적 자극에 될 수 있습니다 안정적이고 제어 미세 환경 세포를 제공해야한다. 예를 들어, 마이크로 유체 칩은 세포의 주 화성을 연구하는 데 사용됩니다. 대신에 보이든 챔버와 모세관 4,5 이러한 소형 유체 장치는 세포의 행동 1,6,7을 공부 정밀 화학 그라디언트를 생성 할 수 있습니다 사용 전통적인 방법. 또 다른 예는 전기장 (EFS), 현상이라는 electrotaxis에서 세포의 방향 이동을 연구하는 것입니다. 셀 Electrotactic 동작은 신경 재생 8, 9 배 발생과 관련된 것으로보고 된그리고 10, 11 상처 치유. 많은 연구는 14,15 림프구 암세포 (12, 13)을 포함하는 다양한 세포 유형의 electrotaxis을 조사 백혈병 세포 (11)을 수행하고, 세포를 16 줄기되었다. 통상적으로, 배양 접시와 커버 유리는 EFS (17)를 생성하기위한 electrotactic 챔버를 구성하는 데 사용됩니다. 이러한 간단한 설정은 중간 증발과 부정확 한 EFS의 문제를 제기하지만, 그들은 동봉, 잘 정의 된 유체 채널 12,18,19의 미세 유체 장치에 의해 극복 될 수있다.
체계적으로 정밀 제어 및 전기 화학적 자극 하에서 세포 반응을 연구하기 위해, 동시에 복수의 자극을 가진 세포를 제공 할 수있는 미세 유체 소자를 개발하기 위해 아주 유용하게 사용될 것이다. 예를 들면은, 리튬 등. 하나 만들거나 화학 그라데이션 및 EFS (20)를 공존을위한 PDMS 기반 미세 유체 장치를보고했다. 카오는 등. DEVEFS 6 폐암 세포의 주 화성을 조절 유사한 미세 유체 칩을 눈 맞아 달아. 또한, 처리량, 허우 등의 알을 증가시킵니다. 설계 8 가지 조합 자극되고 (2 EF 강도 × 4 화학적 농도) 21 셀을 제공하는 PMMA 기반 멀티 – 이중 전계 칩 제조. 또한 전역을 증가시키고 전단 응력 자극을 추가하려면, 우리는 단일 또는 공존 화학 / 전기 / 전단 응력 자극에 따라 세포 반응을 연구하기위한 두 PMMA 기반 미세 유체 장치를 개발했다.
소호 등의 알. 22, 23으로보고,이 장치는 생체 순환 시스템을 흉내 낸 연속 유체 흐름에 따라 다섯 가지 독립적 인 세포 배양 채널을 포함한다. 제 1 칩 (화학 전단 응력 칩 또는 CSS 칩) 다섯 대하여 0의 농도를 1/8, 1/2, 7/8, 및 1 배양 영역에서 발생하고, 전단 응력 구배이다되고 produ의다섯 문화 각 영역 내부 세드릭. 제 칩 전극 중 하나의 세트와이 주사기 펌프를 사용하여 (화학 – 전계 칩 또는 CEF 칩)에서, 다섯 EF 강도는 이러한 배양 영역 내에서 다섯 가지 화학 물질의 농도에 부가하여 발생된다. 수치 계산과 시뮬레이션 나은 설계를 수행하고 이러한 칩을 제공하고,이 장치의 내부에 배양 폐암 세포는 반응성 산소 종의 생성과 관련하여 자신의 응답을 관찰하는 단일 또는 공존 자극 (ROS) 적용을 받는다 마이그레이션 속도 및 마이그레이션 방향. 이 칩은 시간을 절약 세포는 다양한 마이크로 환경 자극에 어떻게 반응하는지 조사에 대한 높은 처리량과 신뢰할 수있는 장치로 입증된다.
Protocol
Representative Results
Discussion
PMMA 계 칩보다 복잡한 소프트 리소그래피를 필요 PDMS 기반의 칩에 비해 저렴하고 쉬운 방법이다 레이저 어블 및 기입을 사용하여 제조된다. 미세 유체 칩을 설계 한 후, 제조 및 조립은 5 분 이내에 수행 할 수 있습니다. 주의 실험을 수행에 지급해야 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 첫 번째는 "부착"문제이다. 어댑터는 칩의 최상위 계층에 제대로 붙어해야합니다. 너무이인가되면 접착제 ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was financially supported by the Ministry of Science and Technology of Taiwan under Contract No. MOST 104-2311-B-002-026 (K. Y. Lo), No. MOST 104-2112-M-030-002 (Y. S. Sun), and National Taiwan University Career Development Project (103R7888) (K. Y. Lo). The authors also thank the Center for Emerging Material and Advanced Devices, National Taiwan University, for the use of the cell culture room.
Materials
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11965-092 | Cell culture medium |
| Trypsin | Gibco | 25300-054 | detach cell from the dish |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10082147 | Cell culture medium |
| 10-cm cell culture Petri dish | Nunc | 150350 | Cell culture |
| Bright-Line Hemacytometer | Sigma | Z359629 | Cell Counting Equipment |
| PMMA | Customized | Customized | Microfluidic chip |
| Adaptor | Customized | Customized | Microfluidic chip |
| 0.07/0.22 mm double-sided tape | 3M | 8018/9088 | Microfluidic chip |
| Low melting point agarose | Sigma | A9414 | Salt bridge |
| 2'-7'-dichlorodihydrofluoresce diacetate | Sigma | D6883 | Intracellular ROS measurement |
| Indium tin oxide (ITO) glass | Merck | 300739 | Heater |
| Proportional-integral-derivative controller | JETEC Electronics Co. | TTM-J4-R-AB | Temperature controller |
| Thermal coupler | TECPEL | TPK-02A | Temperature controller |
| CO2 laser scriber | Laser Tools & Technics Corp. | ILS2 | Microfluidic chip fabrication |
| Syringe pumps | New Era | NE-300 | Pumping medium and chemicals into the chip |
| Power supply | Major Science | MP-300V | Supplying direct currents |
| Inverted microscope | Olympus | CKX41 | Monitoring cell migration |
| Inverted fluorescent microscope | Nikon | TS-100 | Monitoring cell migartion and fluorescencent signals |
| DSLR camera | Canon | 60D | Recording bright-field images |
| CCD camera | Nikon | DS-Qi1 | Recording fluorescent images |
| super glue | 3M Scotch | 7004 | Attaching adaptors to PMMA substrates |
| AutoCAD | Autodesk Inc. | Designing microfluidic chips | |
| DMSO | Sigma | D8418 | Dissolving DCFDA |
| ImgeJ | National Institutes of Health | Quantifying fluorescent intensities and cell migration |
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