Behavioral assays provide powerful tools for understanding neuronal function. Here we present several protocols for quantifying predatory feeding behavior found in the model nematode Pristionchus pacificus and its relatives. Additionally, we provide methods for analyzing predatory feeding adaptations including mouth structures and teeth.
This protocol provides multiple methods for the analysis and quantification of predatory feeding behaviors in nematodes. Many nematode species including Pristionchus pacificus display complex behaviors, the most striking of which is the predation of other nematode larvae. However, as these behaviors are absent in the model organism Caenorhabditis elegans, they have thus far only recently been described in detail along with the development of reliable behavioral assays 1. These predatory behaviors are dependent upon phenotypically plastic but fixed mouth morphs making the correct identification and categorization of these animals essential. In P. pacificus there are two mouth types, the stenostomatous and eurystomatous morphs 2, with only the wide mouthed eurystomatous containing an extra tooth and being capable of killing other nematode larvae. Through the isolation of an abundance of size matched prey larvae and subsequent exposure to predatory nematodes, assays including both “corpse assays” and “bite assays” on correctly identified mouth morph nematodes are possible. These assays provide a means to rapidly quantify predation success rates and provide a detailed behavioral analysis of individual nematodes engaged in predatory feeding activities. In addition, with the use of a high-speed camera, visualization of changes in pharyngeal activity including tooth and pumping dynamics are also possible.
その小さいながらも複雑な神経系との線虫は行動を含む神経生物学の多くの側面を理解するための強力なツールを証明しています。この研究の多くは、異なる挙動の富が正常解剖と分析されたモデル生物線虫(Caenorhabditis elegans)に焦点を当てています。これらは3、走化性4、thermotactic 5,6と走磁性7は 10と給電行動11の学習、8,9を交配影響を与える機械刺激が含まれます。しかしながら、他のより遠縁の線虫種はrhabditid C.において観察されていない行動を表示しますエレガンスまたは代替的には、彼らの進化と規制に関する適切な質問を提起複雑さの追加レベルを示しています。このような1つのインスタンスは、はるかに複雑給電することが表示され遠縁diplogastrid線虫Pristionchus pacificus、で観察することができますC.で観察されるよりもhaviorsとリズム両種は、相同な咽頭ニューロン12を共有するにもかかわらず、 エレガンス1。です。これらの追加の摂食行動、P.と一致彼らはまた、他の線虫の幼虫に供給することにより、それらの細菌の食事を補うことのできる熱心な捕食者であるとしてpacificusはまた、拡大食事の範囲を表示します。幸いなことに、P。 pacificusは、比較と統合進化生物学のモデルとして開発されているので、多くの分子および遺伝学的ツールが利用可能になりました。これらは、その新たに発見された姉妹種を含む25以上の近縁種と導入遺伝子14およびCRISPR / Cas9 15,16だけでなく、詳細かつ十分に注釈を付け系統発生17を含む分子や遺伝子ツールを完全に配列決定し、注釈付きのゲノム13が含まれます。また、多数のPristionchus種の生態は、Pを含みますpacificusは、私たちです多くの種で定義されたllが今スカラベカブトムシとnecromenic協会、彼らは頻繁に他の線虫種18と共有するホストを共有して説明した。P. pacificusは、したがって、小説行動の進化とその生態学的意義を分析する優れたモデル系を提供します。
このようなP.などの線虫種における捕食摂食行動を分析するために、 pacificusは、我々は簡単に観察し、捕食行動の定量化のためのいくつかの新規な行動アッセイを開発しました。 P.としてpacificusは強く正しい形態型の識別が不可欠1,2である、捕食行動に影響を与える二形口の構造が表示されます。狭い口のstenostomatousモーフは、単一の鈍背側の歯が含まれており、任意の捕食送りに従事していません。また、広口eurystomatousモーフは、はるかに大きな爪状の背側の歯と反対側の追加を含み一緒に効率的に獲物のキューティクルを開くように動作するサブ腹歯、。非捕食stenostomatous形に捕食eurystomatousの比率は、P内でもPristionchus種間で異なり、 pacificus、しかし、eurystomatous口の割合はP.にモーフィング90%2 – pacificus野生型株(PS312)は、通常70です。また、口の形比は(飢餓といくつかの小さな分子のシグナル伝達だけでなく、未知の要因を含む両方が知られている、)環境の影響の違いに応じて変動することができ、このように捕食eurystomatous口の形の正確な同定および単離は、成功した捕食性アッセイのために不可欠です。
捕食口の形の記述と並んで、私たちは、直接観察や、かむ殺害し、イベントを供給するなどの捕食行動の定量化のための「一口アッセイ」を開発しました。ここで獲物の線虫は、フィルタを介して分離されています新たに飢えた文化のると捕食成人Pにさらさ短い時間スパンで一緒に観察されるpacificus、。また、我々はまた、捕食イベントの間接的な観察によって捕食行動の迅速なスクリーニングを容易にするためのハイスループット「死体アッセイ」を開発しました。これは、捕食のためにスクリーニングするためのツールとして、幼虫の死体の存在を利用しています。両アッセイは、P.などの線虫種で略奪行為を観察し、測定するための簡単かつ再現性の高い方法を提供しますpacificus。
線虫は、Cで神経生物学や行動を理解するための強力なシステムを提供しますエレガンスは、これまでの主要なツールです。 P.含めしかし、多数の線虫種存在しないか、モデル生物C.から複雑で変化pacificus表示行動、 エレガンス 、したがって、これらの行動の進化と規制に関する魅力的な疑問を提起。 P.を含む他の多くの線虫種に見られるそのような追加的行動pacificusは捕食送り1、20に係合することによって、それらの細菌の食事を補うための能力である。そこで我々は線虫で、これらの以前に未分析の捕食行動の簡単かつ迅速な特性評価のための詳細なプロトコルを開発し、説明してきました。
まず、我々は線虫の口の中に装置を供給するのばらつきをスクリーニングするための方法を提供してきました。正しい口のタイプの識別は必須の最初のです成功捕食アッセイのためのTEP少なくともPristionchus属内のみeurystomatous動物が捕食給餌することが可能である、として。それは、この方法のようなプロトコル1.2に記載された「迅速な口の表現型」プロトコルでモーフはるかに低侵襲性であり、したがって、捕食行動が摂動することができることにくい、口を識別するのが最善です。しかし、最初に寒天パッド(プロトコル1.1)で麻酔した動物との識別によって異なる口の構造に慣れることをお勧めします。
希望の口のモーフを同定した後、我々は捕食送を定量化するための2つのアッセイを記載しています。これらは、迅速な高スループット「死体アッセイ」(プロトコル3)であり、より多くの時間は「一口アッセイ」(プロトコル2)を介して、詳細な行動分析を消費するが、より。これらのプロトコルは両方ともexperimenによってアッセイを最適化するためにいくつかの変更を可能にする非常に柔軟ですタル要件。 P.を用いて咬合アッセイのためC.上のpacificusの捕食者エレガンスの餌は、10分の時間ウィンドウの捕食行動の相互作用の観察は、他の摂食イベントと共に咬傷のかなりの量を定量化するのに十分でした。もう一度Pを利用した「死体アッセイ」とは、 C.上のpacificusの捕食者エレガンスの獲物は、2時間5捕食者は、迅速な行動解析を可能にし、容易に定量化し、一貫性のある死体の数を生産しました。しかし、それは異なる速度で捕食線虫の動きの異なる種を注意すべきである、異なる速度で食べて、一般的に他の行動1に大きな多様性を実証します。さらに、異なる餌の種も同様の理由のために異なる速度で食べてもよいです。したがって、捕食者と獲物として、また、環境条件の違いのために、両方の試験された線虫種に基づいたアッセイを最適化することをお勧めします。 「かま」と「軍団の両方の間ストレスやけがの捕食者が効率的に殺すことはありませんように獲物と捕食者の両方が、健康であることが重要である。また、新鮮なアッセイプレートは古いプレートとして必要不可欠であるe」のアッセイは悪影響誤っにつながる線虫の健康に影響を及ぼしているかを乾燥させてしまうことができますアッセイ。Cで観察された多くの行動を調査するためになされたものであり、これらの捕食アッセイの将来の反復は、分析の多くを自動化するために、技術の最近の進歩を活用できるようになることも期待されている21、22 エレガンス 。現在、問題は、彼らが捕食摂食を阻害する可能性が高いマイクロ流体室に分離し、固定化を行うこと、連絡することをはるかに敏感現れるなどのP. pacificusとして線虫において発生する可能性がある。これを克服困難な証明するかもしれないが、微妙な捕食のためにスクリーニングするために、個々の線虫を容易にするであろう行動。
最後に、我々はまた、foの方法を提供してきましたR高速カメラ(プロトコル4)を使用して歯と咽頭ポンピング速度を定量することによって捕食および細菌給電モードとの間の比較を容易にする線虫供給装置自体を調べます。 C.中咽頭ポンピング速度の定量化エレガンスは、C、しかし、長年23給監視するために利用されていますエレガンスは、口の歯状突起の任意のフォームを欠いており、また、捕食行動を欠いています。歯活性のものと咽頭ポンピングの定量を組み合わせることを通じて、捕食に特定の歯の任意の神経支配も観察することができます。動物はしばしば、焦点面の外に移動し歯の移動を観察するために必要な倍率に、したがって、短い時間窓のための歯を観察する通常のみ可能です。また、C.とは異なり、 エレガンス 、Pの咽頭pacificusは、継続的にむしろそれがポンピング及び給餌の呪文に従事し、ポンプはありません。そのため、正確な咽頭PUM用ピング速度決定する供給しながら、連続供給の15秒を記録することが重要です。
したがって、ここで紹介するこれらの方法は、線虫のシステムで捕食行動を調査するための第1のフレームワークを提供します。また、彼らはまた、微生物、真菌およびダニなどの捕食に加えて、生態学的に関連する生物の影響を含む、線虫の生態系内の他の相互作用を調査する際に使用するために適応することができます。したがって、彼らはまた、彼らの生態学的意義を、これらの捕食行動は、規制されているそれらがどのように進化してきたことがどのように分析する手段を提供します。
The authors have nothing to disclose.
We thank Dr. Daniel Bumbarger for the predation behavior picture. This work was funded by the Max-Planck Society.
Nylon net filters (20 um) | Merck Millipore Ltd | NY2004700 | Used to filter worms just leaving larvae for use as prey. |
PP Funnel for filter (54mm) | Duran | 292215003 | Used to filter worms just leaving larvae for use as prey. |
Small petri dish (35/10 mm) | Greiner Bio-One | 627102 | For imaging on High speed camera |
Zeiss SteREO Discovery V12 | For mouth form identificaton | ||
Axio-Imager A1 | For mouth form identificaton | ||
Glass Slides | Roth | H869 | |
Cover Slips | Roth | 657 | |
Motion Scope M3 Highspeed camera | IDT | High speed camera | |
Video zoom 44 ENG 1/2" 0.5x to 2.4x | Zeis | 452984-0000-000 | High speed camera zoom |
Nematode Growth Medium (NGM) ingredients: | |||
Agar | Roth | 5210.2 | CAS-Nr. 9002-18-0 |
Sodium chloride (NaCl) | Roth | 3957 | CAS-Nr. 7647-14-5 |
Bacto Tryptone | BD | 211699 | Lot 4316614 |
Calcium chloride dihydrate (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C3306 | CAS-Nr. 10035-04-8 |
Cholesterol from lanolin | Sigma-Aldrich | F 26732 00050 | CAS-Nr. 57-88-5 |
Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4) | Merck | 1,058,861,000 | CAS-Nr. 10034-99-8 |
Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | ACROS organics | 271080025 | CAS-Nr. 7778-77-0 |
6 cm petri dish | Greiner Bio-One | 628102 | |
3.5 cm petri dish | Greiner Bio-One | 627102 | |
M9 ingredients: | |||
Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | ACROS organics | 271080025 | CAS-Nr. 7778-77-0 |
Sodium hydrogen phosphate heptahydrate (NaHPO4) | Sigma-Aldrich | S9390-500G-D | CAS-Nr. 7782-85-6 |
Sodium chloride (NaCl) | Roth | 3957 | CAS-Nr. 7647-14-5 |